鱼类肠道益生地衣芽孢杆菌FA6发酵工艺的响应面法优化

潘美井 王桂堂吴山功

(1.大连海洋大学水产与生命学院,大连 116023;2.中国科学院水生生物研究所,武汉 430072)

抗生素等化学药物的长期使用,造成了水产养殖中药物残留、病原菌耐药性增强及食品安全等问题,因而受到了许多国家和地区的限制使用[1]。益生菌能够改善养殖水环境,刺激免疫系统发育,维持肠道微生态平衡,提高生长性能等[2—5],近年来逐渐地替代抗生素等化学药物,应用于水产养殖。

芽孢杆菌是水产养殖中常用的益生菌[6,7],但是水产养殖中使用的芽孢杆菌很多都不是鱼类自身来源的菌株。地衣芽孢杆菌FA6(Bacillus licheniformisFA6)是本实验室从草鱼的肠道中分离出的一株芽孢杆菌,其可以耐受高温和胆汁酸,分泌多种胞外酶,改善草鱼的生长性能、抗氧化能力、肠道屏障能力和抗病性[8]。地衣芽孢杆菌FA6经发酵扩大培养后,可制成应用于水产养殖的菌制剂。发酵培养基成分和发酵条件对微生物发酵液含菌量有很大的影响[9—11],但是地衣芽孢杆菌FA6的发酵培养基和发酵条件还不清楚,需要确定和优化。

芽孢杆菌液体发酵工艺优化一般使用单因素实验和正交实验,在考察的因素较多时,这些方法不仅实验量大、成本高、耗时长,而且可能导致不可靠的结论[12,13]。响应面法(Response Surface Methodology,RSM)可同时对影响生物量的各个因子水平及其交互作用进行优化和评价,从而快速有效地确定多因子系统的最佳的组合[14—16]。

本研究采用单因素实验和响应面法实验对地衣芽孢杆菌FA6发酵培养基和发酵条件进行优化,以期获得其活菌含量最高的发酵培养基配方和发酵条件,为其在高密度生产,产业化应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

地衣芽孢杆菌FA6是本实验室前期从草鱼肠道中分离获得,菌液保存于-80℃冰箱。

1.2 培养基

LB液体培养基作为种子培养基和初始发酵培养基,含胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L和NaCl 10 g/L,pH 7.0—7.2。固体培养基则在LB液体培养基中加入15 g/L的琼脂作为凝固剂。

1.3 培养条件

种子菌液培养条件: 接种量为一接种环的单菌落,发酵温度37℃、装液量50 mL/250 mL、转速120 r/min、发酵时间24h。

初始发酵培养条件: 接种量为2%的种子菌液,发酵温度37℃、装液量50 mL/250 mL、转速120 r/min、发酵时间24h。

1.4 活菌数的测定

活菌数的测定采用稀释涂布平板计数法[17]。

1.5 单因素实验

初始发酵培养基和其他发酵条件保持不变的情况下,探究培养基初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0时、接种量分别为0.5%、1%、2%、4%或8%时、发酵时间分别为8h、12h、16h、20h、24h、29h、32h或36h时、发酵温度分别为17℃、22℃、27℃、32℃、37℃或42℃时、转速分别为60、90、120、150或180 r/min时,以及装液量分别为25 mL/250 mL、50 mL/250 mL、100 mL/250 mL、150 mL/250 mL或200 mL/250 mL时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数的变化。通过地衣芽孢杆菌FA6活菌数的比较分析,确定最适的初始pH、接种量、发酵温度、发酵时间、转速和装液量,得到最佳发酵条件。

以初始发酵培养基为对照组,用10 g/L的可溶性淀粉(原料为马铃薯)、玉米淀粉、玉米糊精、乳糖、麦芽糖、蔗糖或葡萄糖替换初始发酵培养基的碳源(胰蛋白胨)。在最佳发酵条件下发酵后,测定地衣芽孢杆菌FA6活菌数,以确定发酵培养基的最佳碳源。再分别添加10、20、30、40、50、60或70 g/L的最佳碳源,以确定最佳碳源的最适添加量。

以初始发酵培养基为对照组,用10 g/L的蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸膏、豆粕粉、大豆蛋白胨替代初始发酵基础培养基的氮源(酵母提取物)。在最佳发酵条件下发酵后,测定地衣芽孢杆菌FA6活菌数,以确定发酵培养基的最佳氮源。再分别添加10、20、30、40、50或60 g/L的最佳氮源,以确定最佳氮源的最适添加量。

以初始发酵培养基为对照组,通过在初始发酵培养基中添加1 g/L的MnSO4、CaCl2、KH2SO4、K2HPO4、Na2HPO4或MgSO4,在最佳发酵条件下发酵后,测定地衣芽孢杆菌FA6活菌数,以确定可以添加至培养基的无机盐种类。

1.6 响应面法实验

根据单因素实验结果,Plackett-Burman Design(PBD)实验选取可溶性淀粉、酪蛋白胨、NaCl、MgSO4、Na2HPO4、K2HPO4、KH2SO4、初始pH、接种量、装液量、发酵温度、发酵时间和转速共计13个发酵因素作为自变量(X1、X2··· X13),以地衣芽孢杆菌FA6活菌数作为响应值(Y),筛选出显著影响地衣芽孢杆菌FA6活菌数的发酵因素。利用Design expert 11.0软件制定PBD实验方案(表1),每个发酵因素设置两个水平,低水平(-1)为其单因素实验的最佳值,高水平(+1)取低水平的1.25—2倍[18,19];PBD实验共20个组(表2)。当发酵因素的置信度高于90%(P＜0.05)时,表明其对地衣芽孢杆菌FA6活菌数有显著影响。

表1 Plackett-Burman Design实验的因素及水平Tab.1 Factors and levels of the Plackett-Burman Design experiment

表2 Plackett-Burman Design实验的设计及结果Tab.2 Design and results of Plackett-Burman Design experiment

根据PBD实验结果,选取显著影响地衣芽孢杆菌FA6活菌数的3个发酵因素进行最陡爬坡实验(表3)。参考王瑶等[20]的研究方法,依据3个发酵因素影响地衣芽孢杆菌FA6活菌数的正负效应,确定其爬坡方向和步长,快速逼近最佳区域,以此获得Box-Behnken Design(BBD)实验的中心点。

表3 最陡爬坡实验的设计及结果Tab.3 Design and results of Steepest Climbing experiment

根据PBD实验和最陡爬坡实验的结果,使用软件Design-Expert 11.0设计3因素3水平的BBD实验(表4)。BBD试验的因素为PBD实验筛选出的3个发酵因素,每个发酵因素设置3个水平,零水平(0)为最陡爬坡实验确定的中心点,低水平(-1)和高水平(+1)为零水平的±1.5倍,其他发酵因素与其单因素实验的最佳值保持一致。BBD实验共17个组,包含5个中心点(表5)。BBD试验结果采用软件 Design-Expert 11.0拟合回归方程和方差分析,并通过回归方程预测地衣芽孢杆菌FA6活菌数的最优值及其对应最优发酵工艺。

表4 Box-Behnken Design实验的因素及水平Tab.4 Factors and levels of Box-Behnken Design experiments

表5 Box-Behnken Design实验的设计及结果Tab.5 Design and results of Box-Behnken Design experiment

根据BBD实验结果,将地衣芽孢杆菌FA6置于预测的最佳发酵培养基和发酵条件下进行发酵实验。通过发酵实验获得地衣芽孢杆菌FA6活菌数的实际值,并计算预测值与实际值的相对误差。将在初始发酵培养基和初始发酵条件下发酵作为对照组,计算优化效率。

1.7 数据处理与分析

采用单因素方差分析(One-way ANOVA)组间差异,以P＜0.05作为差异显著性水平;采用Design Expert 11.0 软件进行响应面实验设计及其结果分析,采用GraphPad Prism 8.0 软件进行单因素实验结果的统计和分析[21,22]。

2 结果

2.1 单因素试验

初始pH对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响如图1所示,在初始pH为4.0—10.0,随着初始pH的增大,地衣芽孢杆菌FA6活菌数先增加后减少。当初始pH为7.0时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数达到最大,为1.00×109CFU/mL,但与初始pH为5.0、6.0或8.0的活菌数无显著性差异(P＞0.05)。当初始pH为4.0、9.0或10.0时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数显著低于初始pH为7.0的活菌数(P＜0.05)。因此,地衣芽孢杆菌FA6发酵的最佳初始pH为7.0。

图1 不同发酵条件对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响Fig.1 Effects of different fermentation conditions on the number viable bacteria ofBacillus licheniformisFA6

接种量对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响如图1所示,在接种量为0.5%时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数最低,为1.37×109CFU/mL。在接种量为1%时,地衣芽孢杆菌FA6的活菌数最高,为2.08×109CFU/mL,显著高于接种量为0.5%的活菌数(P＜0.05);并高于接种量为2%的活菌数,但不显著(P＞0.05)。因此,地衣芽孢杆菌FA6发酵的最佳接种量为1%。

发酵时间对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响如图1所示,随着发酵时间的增加,地衣芽孢杆菌FA6活菌数先增加后减少。在发酵时间为20h时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数最高,为3.27×109CFU/mL,显著高于其他所有发酵时间的活菌数(P＜0.05)。因此,地衣芽孢杆菌FA6发酵的最佳时间为20h。

发酵温度对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响如图1所示,随着发酵温度的升高,地衣芽孢杆菌FA6活菌数先增加后减少。在发酵温度为27℃时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数最高,为3.49×109CFU/mL,显著高于发酵温度为22和32℃时的活菌数(P＜0.05)。因此地衣芽孢杆菌FA6发酵的最佳温度为27℃。

转速对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响如图1所示,随着转速的增大,地衣芽孢杆菌FA6活菌数先增加后减少。当转速为150 r/min时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数最高,为1.42×109CFU/mL,与转速为120和180 r/min的活菌数无显著差异(P＞0.05),但显著高于转速为60 r/min时的活菌数(P＜0.05)。因此,地衣芽孢杆菌FA6发酵的最佳转速为150 r/min。

装液量对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响如图1所示,随着装液量的增加,地衣芽孢杆菌FA6活菌数先增加后减少。当装液量为50 mL/250 mL时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数最高,为0.94×109CFU/mL,并显著高于装液量为25 mL/250 mL和100 mL/250 mL的活菌数(P＜0.05)。因此,地衣芽孢杆菌FA6发酵的最佳装液量为50 mL/250 mL。

碳源及其添加量对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响如图2所示,当可溶性淀粉作为碳源时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数最高,为1.08×109CFU/mL,其次是玉米淀粉,为1.0×109CFU/mL,且显著高于对照组的活菌数(P＜0.05)。当葡萄糖或蔗糖作为碳源时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数均显著低于LB培养基中的活菌数(P＜0.05),分别为3.12×107和4.37×107CFU/mL。因此,地衣芽孢杆菌FA6发酵培养基的最佳碳源为可溶性淀粉。随着可溶性淀粉添加量的增加,地衣芽孢杆菌FA6活菌数先增加后减少。当可溶性淀粉的添加量为50 g/L时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数最高,为3.05×109CFU/mL。综上所述,地衣芽孢杆菌FA6发酵培养基的最佳碳源为可溶性淀粉,其最适添加量为50 g/L。

图2 不同碳源、氮源或无机盐及其添加量对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响Fig.2 Effects of different carbon sources,nitrogen sources or inorganic salts and their concentration on the number viable bacteria ofBacillus licheniformisFA6

氮源及其添加量对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响如图2所示,当酪蛋白胨作为氮源时,地衣芽孢杆菌活菌数最高,为1.85×109CFU/mL,其次是蛋白胨,为1.68×109CFU/mL,且显著高于对照组的活菌数(P＜0.05)。当大豆蛋白胨作为氮源时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数最低,为2.87×108CFU/mL,显著低于对照组的活菌数(P＜0.05)。因此,地衣芽孢杆菌FA6发酵培养基的最佳氮源为酪蛋白胨。最佳氮源添加量对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响如图2所示。随着酪蛋白胨添加量的增加,地衣芽孢杆菌FA6活菌数先增加后减少。当氮源添加量为40 g/L时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数最高,为3.97×109CFU/mL。综上所述,表明地衣芽孢杆菌FA6发酵培养基的最佳氮源为酪蛋白胨,其最适添加量为40 g/L。

无机盐对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响如图2所示,当LB基础培养基中添加MgSO4、KH2PO4、K2HPO4或Na2HPO4时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数均显著高于对照组(P＜0.05)。当LB培养基添加MgSO4时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数最高,为2.84×109CFU/mL,与对照组差异显著(P＜0.05)。当加LB培养基添加CaCl2时,地衣芽孢杆菌FA6活菌数最小,为6.53×108CFU/mL,与对照组差异不显著(P＞0.05)。综上所述,MgSO4、KH2PO4、K2HPO4和Na2HPO4可作为无机盐,添加至地衣芽孢杆菌FA6发酵培养基。

2.2 响应面法实验

Plackett-Burman Design实验PBD实验模型的决定系数R2=0.9060,矫正系数R2Adj=0.7025,P=0.0385＜0.05,表明该实验模型可靠(表6)。可溶性淀粉(X1)、KH2PO4(X7)、发酵温度(X11)和转速(X13)对地衣芽孢杆菌FA6活菌数有显著影响(P＜0.05),其显著影响大小顺序为: 发酵温度＞可溶性淀粉＞转速＞ KH2PO4(表6)。因此,发酵温度、可溶性淀粉和转速是影响地衣芽孢杆菌FA6活菌数最显著的3个发酵因素。

表6 Plackett-Burman Design实验的统计分析结果Tab.6 Statistical analysis of the Plackett-Burman Design experiment

最陡爬坡实验在最陡爬坡实验中,可溶性淀粉和转速对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响具有正效应,其水平逐渐增加;发酵温度具有负效应,水平逐渐减小(表3)。地衣芽孢杆菌FA6活菌数在第3组实验达到最高值,为5.46×109CFU/mL,对应的淀粉60g/L、发酵温度27℃和转速140 r/min可作为BBD实验的中心点(表3)。

Box-Behnken Design实验采用Design-Expert 10.0软件对BBD实验结果进行回归拟合,得到二阶回归方程为:Y=674.00+12495A+27.35B+77.75C+17.20AB+53.85AC+32.20BC-273.43A2-23.08B2-3.27C2。回归方程的决定系数R2=0.9326,矫正系数R2Adj=0.8460,表明该回归方程的拟合性较好;回归方程模型P=0.0024(＜0.01),失拟项P=0.6994(＞0.05),表明回归方程的模型可信(表7)。因此,可用该回归方程预测地衣芽孢杆菌FA6活菌数的最优值。回归方程预测地衣芽孢杆菌FA6活菌数的最优值为8.20×109CFU/mL,对应发酵因素为: 发酵温度(A)28.8℃、可溶性淀粉(B)70 g/L、转速(C)160 r/min。

表7 Box-Behnken Design实验的统计分析结果Tab.7 Statistical analysis of Box-Behnken Design experiment

方差分析显示,模型中可溶性淀粉和转速的一次项差异显著(P＜0.05),发酵温度的二次项差异极显著(P＜0.001),而发酵温度、可溶性淀粉和转速间的交互作用差异不显著(P＞0.05;表7),表明各发酵因素对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响不是简单的线性关系。

在响应曲面图中,发酵温度的响应曲面变化幅度最大且陡峭,其次是转速,而可溶性淀粉响应曲面变化幅度最小且不明显(图3),表明发酵温度和转速显著影响地衣芽孢杆菌FA6活菌数。在等高线图中,发酵温度与可溶性淀粉和转速的等高线图呈椭圆形,可溶性淀粉与转速的等高线图呈圆弧形(图3),表明发酵温度与可溶性淀粉、转速的交互作用显著影响地衣芽孢杆菌FA6活菌数,而可溶性淀粉与转速的交互作用影响不显著。

图3 发酵因素的交互作用影响地衣芽孢杆菌FA6活菌数的响应曲面图及等高线图Fig.3 The interaction of fermentation factors influenced the response surface and contour plots of the number viable bacteria ofBacillus licheniformisFA6

优化后的发酵实验在优化后的发酵培养基和发酵条件下,实际发酵获得的地衣芽孢杆菌FA6活菌数为7.97×109CFU/mL,与预测最优值的相对误差为2.8%。对照组地衣芽孢杆菌FA6活菌数为8.77×108CFU/mL,计算优化效率为提高8.1倍。

3 讨论

工业发酵微生物种类繁多,但鱼类肠道益生菌发酵的研究相对较少。地衣芽孢杆菌FA6是本实验室从草鱼肠道分离的一株芽孢杆菌,具有优异的生物学特性和抗逆性,可应用于水产养殖[8,23]。一般而言,鱼类自身来源的益生菌更适应鱼类肠道环境,更易于在肠道中定殖,从而长期发挥益生作用[24]。优化鱼源益生芽孢杆菌的发酵工艺,能够推动其在水产养殖中应用,进而促进水产养殖的健康与可持续发展。

适宜的培养条件有助于菌株的快速生长和代谢[25,26]。在本研究中,地衣芽孢杆菌FA6需要高转速和低装液量,这与丁泓皓等[27]研究结果一致。提高转速和降低装液量可以增加培养基的氧容量,从而促进微生物的生长[28]。在高密度发酵时,可在地衣芽孢杆菌FA6的对数生长期采用增加通气量和较大转速来提高其生物量。研究发现,温度和pH会直接影响微生物细胞内的酶活性[13]。地衣芽孢杆菌FA6的最佳发酵温度和初始pH与其他研究[29—31]报道的芽孢杆菌的最佳温度和初始pH不同,表明不同芽孢杆菌的培养条件有差异。因此,探究地衣芽孢杆菌FA6的最佳发酵条件显得十分重要,也是开发优良菌株至关重要的环节。

发酵培养基中的营养素类型及其浓度在微生物的生长和代谢中起到重要作用[32]。碳源的代谢速率会影响微生物的生长和代谢,微生物可以直接吸收利用速效碳源,但速效碳源消耗太快易造成微生物营养缺乏,从而提早衰老和自溶;迟效碳源可以克服速效碳源代谢过快产生的弊端,并且营养丰富,来源广泛,价格低廉[33]。值得注意的是,在本研究中可溶性淀粉比葡萄糖更合适作为地衣芽孢杆菌FA6发酵培养基的碳源。这与张皎皎等[26]研究结果相似,即可溶性淀粉作为碳源时,甲基营养型芽孢杆菌WM-1的抑菌活性最强,蔗糖作为碳源时,抑菌活性最低。本研究发现,豆粕粉可以作为地衣芽孢杆菌FA6发酵培养基的氮源,表明地衣芽孢杆菌FA6可以利用植物性蛋白。这使地衣芽孢杆菌FA6采用价格更便宜的植物性蛋白进行发酵,降低发酵成本成为可能。在优化无机盐的实验中,无机盐MgSO4对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的增加具有促进作用。这可能是因为Mg2+作为许多酶、ATP化合物、核糖体和细胞膜稳定的辅助因子,能促进微生物对营养物质的利用及其能量转导,从而提高微生物活菌数[32]。本研究筛选出的碳源、氮源和无机盐及其浓度,对于后续发酵罐扩大培养具有重要的参考意义。

响应面法是一种周期短、试验次数少和精度高且能同时研究多个因素的交互作用的分析方法,广泛应用于生物发酵工程[34,35]。目前利用响应面法对芽孢杆菌产酶、胞外多糖和氨基酸等代谢产物的发酵优化较为常见[36—38]。本研究通过PBD实验筛选出了显著影响地衣芽孢杆菌FA6活菌数的三个发酵因素: 可溶性淀粉、转速和发酵温度。进一步分析等高线图,发现发酵温度与可溶性淀粉及转速的交互作用对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响显著,这与BBD实验的方差分析结果相反。推测是发酵温度对地衣芽孢杆菌FA6活菌数的影响最显著,并且发酵温度逐渐升高时,对地衣芽孢杆菌FA6活菌数增加具有极显著的抑制作用,从而导致其与其他发酵因素的交互作用显著。地衣芽孢杆菌FA6采用最佳发酵工艺进行发酵,实际获得的活菌数与预测值的相对误差小于5%,表明采用响应面法优化发酵工艺可行且有效[39]。

4 结论

本研究以地衣芽孢杆菌FA6为研究对象,通过单因素实验和响应面法实验对发酵初始pH、接种量和发酵时间等发酵条件,以及培养基的碳源、氮源和无机盐的种类及添加量进行了优化,最终确定最佳发酵培养基: 70 g/L可溶性淀粉、40 g/L酪蛋白胨、2 g/L K2HPO4、1 g/L KH2PO4、2 g/L Na2HPO4、2 g/L MgSO4和8 g/L NaCl;以及最佳发酵条件: 初始pH 7.0、接种量 1%、发酵温度 28.8℃、发酵时间 31h、装液量 50 mL/250 mL和转速160 r/min。在此发酵培养基和发酵条件下,地衣芽孢杆菌FA6活菌数可达7.97×109CFU/mL,较优化前提高了8.1倍。最佳发酵工艺的获得,将能够为鱼源芽孢杆菌的高密度生产,产业化应用提供基础。