海南省某奶牛场“两病”净化效果监测分析

韩 荣，朱建明，赵华林

（1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.海南志勤畜牧业技术研究院，海南 三亚 572000）

奶牛“两病”是指布鲁氏菌病和牛结核病，两者均为我国二类动物疫病[1]。世界动物卫生组织（OIE）列为B 类动物疫病。布鲁氏菌病（布病）是一种由布鲁氏菌引起的人畜共患传染病，也被称为“马耳他热”或“波浪热”[2]。它在临床上的特征是母畜发生流产和不孕，而公畜则发生睾丸炎、附睾炎和关节炎[3]。牛结核病是一种慢性传染病，由牛结核杆菌引起，也会在人畜之间传播[4]，其临床特点是产乳量迅速下降，怀孕母牛可能发生流产，体温可上升到40 ℃以上，呈稽留热、呼吸极度困难，最后窒息而死[5]。海南省目前没有发现牛种布鲁氏菌，主要是羊种3 型和猪种3 型[6-7]，未发现牛结核病[8]。牛布病诊断方法主要是通过血清学技术，虎红平板凝集试验（RBT）进行初次筛查、试管凝集试验（SAT）做确诊；牛结核病检测方法主要为免疫学检测，即牛结核菌素皮内变态反应（PDD）。

随着海南建设“自由贸易港”和“国际旅游岛”的快速发展，牛肉及牛奶制品需求量猛增，保证畜产品安全和高质是海南畜牧业在新时代面临的紧迫要求。同时海南省属我国的无规定动物疫病区重点建设省份之一[9-10]，防控和净化奶牛场“两病”是建设“无疫区”的重点内容。持续开展奶牛场“两病”监测对保证海南奶牛养殖业健康发展和公共卫生安全具有重大意义。加大对奶牛主要疫病的净化，将为海南畜牧业建设动物多病种无疫区提供基础保障。

1 材料与方法

1.1 牛场背景

海南省某牛场于2017 年从澳大利亚引进娟珊牛500 头。通过自繁自育，现有育成牛229 头、生产母牛168头、犊牛90头，均未免疫接种牛布鲁氏菌病、牛结核病疫苗。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂

布鲁氏菌病虎红平板凝集抗原、布鲁氏菌病阳性血清、布鲁氏菌病试管凝集试验抗原、提纯牛型结核菌素、虎红反应板，均购自哈药集团生物疫苗有限公司。

1.2.2 主要仪器

恒温培养箱、微量加样器、游标卡尺、5 mL注射器、微量振荡器、冰箱、离心机。

1.3 试验方案

1.3.1 布病检测

采集奶牛血样，按照国标《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646-2018）[11]操作先进行RBT 初次筛查，然后将初筛为阳性个体再进行SAT 复检。确诊为布病阳性的奶牛为阳性个体；阳性个体所在的场群为阳性污染场群。对阳性场开展全群采样检测，扑杀阳性个体，隔离饲养其余健康牛，以后每月进行一次随机采样检测；连续三个月未检测到布病阳性后，将该场设定为假设健康场群，对其进行常规监测。

1.3.2 牛结核检测

按照国标《动物结核病诊断技术》（GB/T18645-2020）[12]进行操作，通过PDD 检测牛结核病，对初检阳性的牛60 d后复检，对复检阳性的牛进行扑杀与无害化处理。

1.4 样品采集

常规消毒后，采集6月龄的母牛与产后半月至1个月的犊牛静脉血样2～5 mL。

1.5 检测方法

1.5.1 虎红平板凝集试验（RBT）

（1）提前1 h从冰箱取出被检血清、布鲁氏菌标准阴、阳性血清和虎红平板凝集实验抗原，平衡到和室温一致；

（2）将30 uL 被检血清和30 uL 虎红抗原加在一次性虎红反应板内，使用灭菌枪头快速混匀，4 min内读取结果；

（3）每批次试验同时用阴性、阳性血清各一份作对照；

（4）结果判定：在标准阴性血清不出现凝集，标准阳性血清出现凝集时，试验成立，方可对受检血清进行判定。出现肉眼可见的凝集反应判定为阳性，记为“+”，无凝集现象且反应混合液呈均匀粉红色者判定为阴性，记为“-”。

1.5.2 试管凝集试验（SAT）

（1）提前1 h从冰箱取出被检血清，布鲁氏菌病阳性血清和试管凝集抗原，平衡到和室温一致；

（2）取6 支试管放于试管架上，依次编号，1 号管为血清对照管，2～5 号为试验管，6 号为抗原对照管；

（3）血清稀释：1号管加2.3 mL生理盐水；2号管不加，第3～6号管各加入0.5 mL生理盐水。取受检血清0.2 mL，加人1号管内，并混合均匀；从1号管中吸0.5 mL 混合液加入2号管并充分混匀，以此类推，做倍比稀释，到第5号管弃去混匀液0.5 mL；

（4）试管凝集抗原做10倍稀释：即1 mL抗原加9 mL生理盐水混匀；从2号管开始各加入0.5 mL，加入抗原之后血清的最终稀释倍数为：从2号管开始为1:25、1:50、1:100、1:200、1:400；

（5）标准比浊管的配置:取5 支试管依次编号；取2 mL 生理盐水和（4）中抗原稀释液2 mL 加入烧杯中混匀；1号管加1 mL生理盐水，2号管加0.25 mL抗原稀释液和0.75 mL生理盐水，3号管加0.5 mL抗原稀释液和0.5 mL 生理盐水，4 号管加0.75 mL 抗原稀释液和0.25 mL 生理盐水，5 号管加1 mL 抗原稀释液；

（6）将加样后的试管充分摇匀置37 ℃培养箱20～24 h，取出室温下放置1 h，检查并记录结果；

（7）结果判断：1号血清对照管清亮无沉淀，6号抗原对照管均匀浑浊，在两种对照管都成立的情况下将试验管与标准比浊管作比较，如果试验管透明度与1号比浊管相近，菌体呈伞状沉淀或块状沉淀，标记为“++++”呈100%凝集；试验管透明度与2号比浊管相近，菌体呈伞状沉淀，标记为“+++”呈75%凝集；试验管与3号比浊管相近，菌体呈较薄伞状沉淀，标记为“++”呈50%凝集；试验管与4号比浊管相近，管底有不明显的伞状沉淀，标记为“+”呈25%凝集；如果试验管不透明无沉淀，标记为“-”呈阴性。

1.5.3 牛结核菌素皮内变态反应（PDD）

（1）提前1 d在牛颈中部上1/3处剪毛或剃毛，三月龄以内的犊牛在肩胛部作试验，用游标卡尺测量术部中央皮皱厚度，作好详细记录；

（2）用生理盐水稀释每毫升含10万国际单位后使用。不论牛只大小，一律皮内注射0.1 mL；

（3）注射后72 h 后，观察局部有无热痛肿胀等炎性反应，并用游标卡尺测量术部皮皱厚度，作好详细记录；

（4）凡判断为可疑反应的牛，即刻在另一颈部以同一批结核菌素进行第二次注射，再经72 h后观察反应；

（5）判断标准：阳性反应，局部有炎性反应，皮厚差等于或大于4.0 mm；可疑反应，局部炎性反应较轻，皮厚差在2.1～3.9 mm；阴性反应，无炎性反应，皮厚差在2.00 mm以下。

2 结果与分析

2.1 布病检测结果

2.1.1 检测

2020-2023 年采集牛血样共2 104 份。其中，RBT 初筛阳性73 份，平均个体阳性率为3.5%；SAT试验确诊阳性0份，阳性率为0，见表1。表明该奶牛场未检出布鲁氏菌病。

表1 奶牛场布病血清学检测结果

2.1.2 时间分布

如表1 所示，该奶牛场的RBT 阳性率2020 年为5.7%，2021 年为3.3%，2022 年为2.3%，2023 年为1.8%，呈逐年下降趋势，表明该牛场布病净化工作效果显著。

根据布鲁氏菌病初检结果，一个月后重新采集73头RBT阳性奶牛的血清，再次进行布鲁氏菌病RBT 初筛与SAT 确诊。结果显示，RBT 阳性依然为73 头，SAT 确诊阳性依然为0 份。综上表明该奶牛场为未患布鲁氏菌病牛场。

2.2 牛结核检测结果

2020—2023 年，总计对2 063 头奶牛进行PDD 试验检测。结果显示，疑似PDD 阳性奶牛总计80头，见表2。对初检疑似PDD 阳性的80 头奶牛60 d 后进行PDD 复检，结果显示，阳性头数均为0，表明该牛场为未患牛结核病牛场。

3 讨 论

目前海南省对奶牛“两病”净化遵循“检测-扑杀-监测-净化”原则。从2020-2023年监测数据显示，海南该牛场未发现“两病”病例，达到了净化标准，表明该牛场已初步建成奶牛“两病”净化场。

在净化监测中，RBT 检测初筛的阳性率为3.5%，而SAT 检测确诊的阳性率为0%，此情况与刘坤洋等[11]研究报道相一致。本研究显示，RBT检测很容易受到特异性抗体的影响呈假阳性。因此在检测中应当保证样品新鲜，避免样品反复冻融和溶血等因素的干扰。而SAT具有较高的特异性和敏感性[12]，能更准确的检测出布病。PDD 疑似阳性率为3.8%，复检阳性率为0%，此情况与李文文和雷程红等[13-14]研究报道相一致。本研究表明，感染其他分支杆菌而致敏的动物没有特异性，因此不能判断病情，同时因病情严重而导致免疫反应低下的动物也易出现假阳性。此外，提纯结核菌素质量、剂量、判定标准及操作等因素的影响也易产生误差[15]。如荷兰英特威的结核菌素，每头牛的剂量为3 000IU[16]，而国产为10 000IU[17]，国际兽疫局规定为3 250IU，不低于2 000IU[18]。国内结核菌素检疫剂量远远超过国际标准剂量，这就导致了结核病阳性和疑似病例的数量增加。因此，本研究严格按照说明书剂量检疫，对于初检判为疑似反应的80头奶牛距上次检疫60 d后复检，结果阳性0头，阳性率为0，由此可见，该牛场未患有牛结核病。

4 结 论

海南该奶牛场2020-2023年连续4年未检出布鲁氏菌病和牛结核病，净化工作成效明显，表明该奶牛场已进入净化维持阶段，已建成海南省首个奶牛“两病”净化场。针对海南奶牛场的实际气候环境和饲养管理状况，该牛场将继续提高疫病防控执行力度，每年至少进行两次针对奶牛布鲁氏菌病和牛结核病的有效检测，保障当地奶牛业稳定发展。