牛肉中三种β-受体激动剂的质谱检测方法

张睿泓，张成成，张炳珏，王成艳，马永顺，王昕泽，杜光光，李海霞*

（1.长春市产品质量监督检验院，长春 130000；2.杭州谱育科技发展有限公司，杭州 310000）

β-受体激动剂药物，属于肾上腺素类的合成药物[1]，于90年代末流入我国，广泛用于畜牧养殖业中，此类药物并非自然产物，而是人工合成的化学药物[2]。它们的主要作用是促进畜禽快速生长，并显著提高瘦肉率。但因为此类药物在动物体内代谢慢，残留时间长，人类长期食用后可能引起心悸、恶心并可伴有肌肉震颤等中毒症状，对人类健康构成严重危害[3]，因此全世界各个国家均将其列为禁用药物。至今，主要有气相色谱质谱联用仪检测技术GC-MS[4-5]、酶标抗体法ELISA[6-7]、高效液相色谱-质谱联用技术HPLC-MS/MS[8-10]等检测方法，但这些方法大多存在样品提取净化过程复杂、成本高、再现性差等缺陷，另有一些检测方法虽然提取过程简单但是存在样品假阳性率高的问题，不适用于准确定量检测。因此，本方法以现有国家标准为基准，优化检测方法，不仅高效准确的完成检测过程，更能减少有机试剂的用量，安全环保，更好的满足牛肉样品的大批量检验检测要求。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与供试材料

乙腈、甲酸、正己烷、乙酸纯度均为色谱纯；沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺浓度均为1 000 mg/L；莱克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3、克伦特罗-D9 浓度均为100 mg/L。购买来源：上海安谱有限公司。QC样品：称取（50±0.01）g牛肉新鲜样品，搅碎至均匀糜状，冷冻保存。

1.2 主要仪器设备

EXPEC 5210 超高效液相—三重四级杆串联质谱仪（杭州谱育科技发展有限公司）、真空脱气机、自动进样器、二元泵、柱温箱、AL104-IC 型分析天平、H1750R 型高速台式冷冻离心机、EOFO-945617型涡旋混合器、N-EVAP112型氮吹仪、NL1E-63型超声清洗机。

1.3 试验过程

1.3.1 标准曲线的配置

精确量取三种目标物混合标准溶液及其对应内标混合标准溶液，经0.1%甲酸水稀释至1.0～50.0 ng/mL浓度范围内的标准工作液。

1.3.2 目标物提取

准确称量（2.00±0.01）g 均匀试样置于50 mL 离心管中，加入内标标液，混匀，静置30 min，加10 mL 0.1%乙酸乙腈溶液，震荡混匀，再超声提取，高速离心5 min（转速为：10 000 r/min），40℃，取全部上清液氮气吹干，加入4 mL 水以饱和正己烷，涡旋混匀，继续加0.5 mL 0.1%甲酸水溶液，剧烈震荡，取水层经滤膜净化后，待测。

1.3.3 色谱和质谱条件

1.3.3.1 液相色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18 分离分析柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱温：40℃；流动相A：0.1%甲酸水；B：乙腈；柱流速：0.4 mL/min，进样量：10 μL；洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序表

1.3.3.2 质谱条件 依据厂商推荐及进一步优化后设定质谱条件，具体参数见表2

表2 正离子模式下三种β-受体激动剂的MRM参数（ESI+）

1.3.3.3 特征离子色谱图和定量离子对 图1中a、b和c为1 ng/mL 的克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇以及对应内标定量离子流色谱图，图2分别为3种β-受体激动剂的两个选择离子质谱图。

图1 定量色谱图

图2 三种β-受体激动剂的2种选择性离子质谱图

2 结果与分析

2.1 线性范围、检出限和定量限

用0.1%甲酸水准确配置标准序列曲线浓度，经仪器检验分析，采用空白基质添加标准溶液的方法，结果见表3。

表3 三种β-受体激动剂的线性回归方程、相关系数、LOD和LOQ

2.2 回收率和精密度

分别向牛肉样品添加3水平的混合标准溶液。并重复测定6次，内标法定量。回收率和相对标准偏差（RSD）见表4。最后得出克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的回收率依次为92.2%～105.7%、94.3%～107.9%和92.2%～102.3%，回收率范围均在60%～120%之间，重复测定下计算精密度结果具体为1.1%～4.2%、2.2%～3.7%和1.7%～3.0%，完全满足标准GB/T 27417-2017[11]中对于准确度的相关要求，同时对质控样品进行试验分析，所得结果见表5。结果表明，质控样品结果均在特性值区间内，回收率满足检验要求，依次判断检测方法可靠，有效。

表4 三种目标物在牛肉中的加标回收率和精密度

表5 质控样品检测结果

3 讨 论

3.1 样品处理与仪器条件的优势

本方法选用0.1%乙酸乙腈溶液为提取液，高速离心振荡提取。与传统方法相比，省去过净化柱这一步骤，在节省试剂耗材成本的同时缩短了检验时间，提高了检测效率。对HPLC-MS/MS 色谱条件进行优化，以0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相，通过系统优化后目标物均在7 min内检测完毕，有效缩短检验时间，减少有机试剂的使用，从而减少了对环境的污染。

3.2 前处理过程注意要点

选用水饱和正己烷作为去脂溶液，且为了避免复溶后样品乳状严重的问题，需要注意应先加入水饱和正己烷混匀后再加入复溶液的方法。此方法不仅复溶液杂质更少，又能避免乳状物的形成，进一步缩短了检验时间。

4 结 论

本试验创建了一套检测牛肉中β-受体激动剂的快速分离方法，该方法精简了前处理提取步骤、优化了色谱和质谱条件，最终得到了较为高效、便捷灵敏、可靠、准确的样品分析检验方法，该方法有助于提升牛肉产品的安全性，避免因残留超标而对消费者健康造成潜在威胁。