改善昼夜节律紊乱减轻糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤

秦小英，刘 慧，韩冲芳，贺建东

1.山西医科大学 麻醉学院，山西 太原 030001；2.山西白求恩医院 麻醉科，山西 太原 030001

昼夜节律作为生物体内的一种重要内源性调节机制,利用光信号与外界环境同步,严密地控制着生物体的饮食、觉醒以及禁食、睡眠等节律,这种节律的同步性确保生物体与外界环境及不同外周器官间生物钟节律的一致[1]。缺血性心脏病是糖尿病的主要心血管并发症和死亡原因,而血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase-myoglobin,CK-MB)活性和肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnⅠ)含量常作为临床首选的生化指标来检测急性心肌缺血,且糖尿病患者的心肌更容易受到缺血/再灌注损伤的影响[2]。在糖尿病患者中,昼夜节律紊乱的发生率很高,昼夜节律紊乱会导致糖尿病的胰岛素敏感性降低,影响糖尿病控制和预后[3]。改善昼夜节律紊乱可以改善血糖水平以及糖尿病的并发症,从而提高糖尿病患者的生活质量。然而,对于改善昼夜节律紊乱对糖尿病心肌缺血/再灌注的研究目前尚不清楚,因此本研究旨在探讨间断补充睡眠是否可减轻昼夜节律紊乱加重的糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:SPF级SD大鼠,体质量250～300 g[山西医科大学实验动物中心提供,实验动物许可证编号:SYXK(晋)2019-0007],严格遵守国家动物福利伦理及保护规定进行实验。

1.1.2 药物、试剂(盒):1%链脲佐菌素(STZ,Sigma-Aldrich公司);ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司);REV-ERBα一抗(武汉爱博泰克生物科技有限公司);BMAL1一抗、GAPDH一抗、二抗(上海艾博抗生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理:将构建成功的糖尿病大鼠分为:假手术组(Sham);缺血/再灌注组(I/R),结扎左冠状动脉前降支(left anterior descending coronary artery,LDA)30 min,再灌注120 min];昼夜节律紊乱组(circadian rhythm disorder,Crd),I/R组基础上,每日持续24 h光照并提供食物使大鼠昼夜节律紊乱);间断补充睡眠组(discontinuous sleep supplementation,Dss),在Crd组基础上,夜间12 h不提供食物,且每光照3 h关闭1.5 h让其补充睡眠。Sham组和I/R组每日光照12 h并规律进食3餐,夜晚关闭光照并停止提供食物。

大鼠禁食12 h,1%戊巴比妥钠60 mg/kg腹腔注射麻醉。持续监测Ⅱ导联心电图。颈部正中第3、4气管软骨环之间行气管切开术,置入16 G气管导管行机控呼吸(参数:潮气量5 mL/200 g,呼吸频率60次/min,吸呼比1∶2)。暴露大鼠左侧腹股沟区,结扎左股静脉远心端,并用28 G套管针穿刺置管。切开胸腔,充分暴露心脏,在左心耳根部下2 mm左右的位置用丝线穿过LDA,在丝线的两端穿过一段硅胶管,缩紧套管并固定丝线以造成大鼠心肌缺血。结扎LDA 30 min,心电图反映出ST段抬高、QRS波增宽增高、T波高尖,同时结扎的远端心尖及左室前壁组织发绀且跳动无力,为结扎成功的标志;结扎30 min后进行120 min再灌注,ST段回落以及结扎的远端心尖及左室前壁组织逐渐变红,是再灌注成功的标志。Sham组LDA仅穿线不结扎;I/R组、Crd组和Dss组LDA均结扎30 min后行120 min再灌注。

1.2.2 三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)法检测心肌梗死体积百分比:随机取5只大鼠,再次结扎其LDA,通过股静脉置管注入3 mL 1%伊文氏蓝(Evans blue)染液,当正常组织完全上色,缺血区组织未染色后,立即处死大鼠,取出其心脏。用冷0.9%氯化钠溶液冲洗心脏,后置于-20 ℃下1 h,垂直于其长轴切成2 mm厚的切片,放入现配的1% TTC溶液中,使之均匀染色,37 ℃孵育5 min,重复3次。用PBS缓冲液冲洗切片后放入4%甲醛组织固定液中固定15 min,扫描仪扫描心脏切片进行保存。正常心肌呈蓝色,缺血区心肌为砖红色,梗死的心肌则为灰白色。用Image ProPlus 7.0图像分析软件(Media Cybernetics公司)计算心脏缺血区体积以及缺血区梗死体积,然后计算出心肌梗死体积百分比,公式为:缺血区梗死体积/缺血区体积×100%。

1.2.3 ELISA检测血清cTnⅠ含量、CK-MB活性:120 min再灌注后,从右侧颈动脉抽取5 mL血样,静置2 min后,2 000 r/min离心15 min,离心半径8.5 cm,随后严格按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.2.4 Western blot测定心肌组织生物钟基因BMAL1、REV-ERBα的表达水平:取心肌缺血区的组织按10 μg/mL的比例加入RIPA裂解液,用超声波粉碎机破碎组织样品后置于冰上裂解10 min,4 ℃离心15 min,12 000 r/min,采取BCA法进行蛋白质定量。取200 μL上清液倒入离心管,以4∶1比例加入5×蛋白质上样缓冲液,将其置于100 ℃,10 min,使蛋白彻底变性。将样品置于冰上进行冷却,4 ℃,2 000 r/min,离心1 min。根据蛋白分子量调配SDS-PAGE分离胶和浓缩胶,通过凝胶电泳和转膜后,用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h,并用TBST洗涤5 min×3次。加入REV-ERBα一抗(1∶1 000)、BMAL1一抗(1∶1 000)、GAPDH一抗(1∶6 000),4 ℃孵育过夜。TBST洗涤5 min×3次,加入二抗(1∶50 000),在室温下孵育2 h,TBST洗涤5 min×3次。用IPWIN60软件处理系统来分析目标条带的吸光度值。以GAPDH为内参,根据BMAL1、REV-ERBα条带吸光度值与GAPDH条带吸光度值之比衡量BMAL1、REV-ERBα的表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 心肌梗死体积百分比及cTnⅠ含量、CK-MB活性

与Sham组相比,I/R组心肌梗死体积明显增大,血清CK-MB活性和cTnⅠ含量明显升高(P<0.05);Crd组同I/R组相比,心肌梗死体积增大,cTnⅠ含量和CK-MB活性升高(P<0.05);Dss组同Crd组相比,心肌梗死体积减小,血清CK-MB活性和cTnⅠ含量降低(P<0.05)(表1)。

表1 大鼠心肌梗死体积百分比及血清中cTnⅠ、 CK-MB的比较

2.2 心肌组织生物钟基因BMAL1、REV-ERBα的蛋白表达

与Sham组相比,I/R组心肌生物钟基因BMAL1表达下调,REV-ERBα上调(P<0.05);Crd组同I/R组相比,心肌组织BMAL1表达下调,REV-ERBα上调(P<0.05);Dss组同Crd组相比,心肌组织BMAL1表达上调,REV-ERBα下调(P<0.05)(图1,表2)。

图1 Western blot检测大鼠心肌组织BMAL1和REV-ERBα的蛋白表达Fig 1 Western blot assay of protein expression of BMAL1 and REV-ERBα in rat myocardial tissue

表2 大鼠心肌组织生物钟基因BMAL1、REV-ERBα相对表达量

3 讨论

生物钟由10个以上相互关联的转录调节因子组成,所有这些调节因子都可能对心脏的代谢过程产生影响,而芳香烃受体核转运蛋白的类似蛋白1(BMAL1)是生物钟转录调节因子的核心组成部分,在心肌细胞稳态中起着重要作用,并受孤儿核受体REV-ERBα的负调控,BMAL1诱导REV-ERBα表达,而REV-ERBα会进一步反馈抑制BMAL1的表达[4],在生物体内的反馈调节中起关键作用。此外,BMAL1在心肌细胞中高度表达,对心脏的代谢、信号转导和收缩功能发挥了关键作用[5]。昼夜节律调节生物钟的运行,研究显示,昼夜节律紊乱可能会影响生物钟基因BMAL1和REV-ERBα的转录,从而加重糖尿病心肌缺血/再灌注损伤[6-9]。在大鼠心肌缺血/再灌注损伤时,BMAL1表达降低,REV-ERBα表达升高[10]。本实验结果显示,与Sham组比较,I/R组心肌梗死体积明显增大,血清CK-MB活性和cTnⅠ含量明显升高,心肌组织生物钟基因BMAL1表达下调,REV-ERBα上调,提示心肌缺血/再灌注模型制备成功;Crd组同I/R组相比,心肌梗死体积百分比增大、血清CK-MB活性和cTnⅠ的含量升高,同时心肌组织生物钟基因BMAL1表达降低、REV-ERBα表达升高,表明昼夜节律紊乱会加重糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤;Dss组与Crd组相比,心肌梗死体积百分比减小、血清中的cTnⅠ含量和CK-MB活性降低,心肌组织钟基因BMAL1表达升高,REV-ERBα表达降低,证明间断补充睡眠可以减轻昼夜节律紊乱加重的糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤。

综上所述,昼夜节律紊乱加重了糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤,而间断补充睡眠则可减轻这种损伤,但对于其具体的机制目前尚不清楚。以上研究结果提示关注昼夜节律对预防糖尿病的并发症是有必要的,但治疗糖尿病相关昼夜节律紊乱的方法仍需进一步研究。