冠心宁片减轻大鼠颈动脉粥样硬化斑块损伤

张秀丽，胡孝刚，莫 俊，陈 铃*

丽水市第二人民医院 1.老年呼吸及重症医学科；2.老年精神科，浙江 丽水 323000

动脉粥样硬化斑块是一种高危斑块,易破裂形成血栓,导致急性心脑血管事件的发生,以及进一步的临床不良事件,如急性心肌梗死、心脏骤停、急性脑梗死等[1]。大量研究表明,氧化应激和炎性反应可以调节斑块进展[2]。因此,开发新的药物抑制氧化应激和炎性反应对于治疗动脉粥样硬化斑块具有重要意义。冠心宁片(Guanxinning tablets)是一种由丹参和川芎组成的传统中药复方制剂。已有研究显示,冠心宁联合氯吡格雷、阿司匹林在治疗冠状动脉粥样硬化斑块上可以明显减轻患者的临床症状[3]。但冠心宁片对动脉粥样硬化斑块形成过程中的氧化应激和炎性反应的影响鲜有报道。相关研究显示,抑制Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路可降低ApoE-/-小鼠粥样硬化斑块面积[4]。但冠心宁片能否通过调控Wnt/β-catenin通路抑制炎性反应和氧化应激进而改善大鼠颈动脉粥样硬化斑块尚不明确。因此,本研究主要探究冠心宁片对动脉粥样硬化斑块形成过程中的氧化应激和炎性反应的影响以及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:96只,8周龄,体质量310～320 g,SPF级雄性SD大鼠[广东蓝岛生物技术有限公司,动物生产许可证号:SCXK(粤)2019-0010]。本研究获得本院动物伦理委员会的批准。

1.1.2 主要试剂:冠心宁片(0.38 g,正大青春宝药业有限公司);阿托伐他汀(atorvastatin)(辉瑞制药有限公司);维生素D3注射液(海南豪创药业有限公司);氯化锂(lithiumchloridemonohydrate,LiCl)(Wnt/β-catenin信号通路激活剂,上海伟寰生物科技有限公司);大鼠超敏C反应蛋白(high-sensitive C-reactive protein,hs-CRP)以及单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)ELISA检测试剂盒(上海富雨生物科技有限公司);大鼠氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins,ox-LDL)、丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)试剂盒(上海白益生物公司);兔源抗Wnt3a、基质金属蛋白酶-9(marix metalloproteinase-9,MMP-9)、β-catenin、GAPDH一抗及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组及处理:将大鼠分为对照组(control)、模型组(model,多次注射维生素D3+高脂饲料饲养+液氮冷冻右侧劲总动脉+多次注射异种蛋白的方式构建颈动脉粥样硬化斑块模型[5])、冠心宁片低、中和高剂量干预模型组(分别灌胃150、300和600 mg/kg冠心宁片[6])、阿托伐他汀组(灌胃2 mg/kg阿托伐他汀[7])、LiCl组(尾静脉注射15 mg/kg LiCl[8])、冠心宁片高剂量(600 mg/kg)+LiCl(尾静脉注射15 mg/kg LiCl)组,每组12只,1次/d,持续8周。

1.2.2 标本收集:末次处理24 h后,收集血清和右侧颈总动脉。

1.2.3 大鼠血脂含量的检测:利用Olympus Au2700全自动生化分析仪检测大鼠血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、三酰甘油(triglyceride,TG)以及低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)的含量。

1.2.4 ELISA检测大鼠血清中MCP-1、hs-CRP含量:严格按照试剂盒说明书检测大鼠血清中MCP-1、hs-CRP含量。

1.2.5 大鼠血清中ox-LDL、MDA含量的检测:按照试剂盒说明书利用分光光度法检测大鼠血清中ox-LDL、MDA含量。

1.2.6 HE染色检测颈总动脉病理:将颈总动脉包埋在石蜡中后切成4 μm厚的切片,再进行HE染色,观察颈总动脉的病理变化情况,并用图像分析仪测量斑块面积及动脉总面积,最后统计斑块总面积/动脉总面积的值的变化。

1.2.7 颈总动脉中Wnt3a、MMP-9、β-catenin蛋白表达的Western blot检测:RIPA裂解液提取颈总动脉总蛋白。取35 μg蛋白进行电泳、转膜、封闭一系列操作后,再在4 ℃下将膜与一抗Wnt3a(1∶3 000)、MMP-9(1∶2 000)、GAPDH(1∶3 000)、β-catenin(1∶3 000)孵育过夜。再与二抗(1∶4 000)孵育1 h。用ECL试剂检测蛋白印迹,Image J软件计算蛋白吸光度值(A值)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 冠心宁片对各组大鼠血脂含量的影响

模型组血清中HDL含量低于对照组,TG、LDL、TC含量高于对照组(P<0.05);与模型组相比,冠心宁片低、中、高剂量组以及阿托伐他汀组HDL含量升高,TG、LDL、TC含量降低,且冠心宁片呈剂量依赖性(P<0.05);与模型组相比,LiCl组HDL含量降低,TG、LDL、TC含量升高(P<0.05);与冠心宁片高剂量组相比,冠心宁片高剂量+LiCl组HDL含量降低,TG、LDL、TC含量升高,(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠血清中TG、TC、HDL、LDL含量比较Table 1 Comparison of TG, TC, HDL and LDL levels in serum of rats in each mmol/L, n=12)

2.2 冠心宁片对各组大鼠血清中MCP-1、hs-CRP含量的影响

模型组MCP-1、hs-CRP含量高于对照组(P<0.05);冠心宁片低、中、高剂量组以及阿托伐他汀组MCP-1、hs-CRP含量低于模型组,且冠心宁片呈剂量依赖性(P<0.05);LiCl组MCP-1、hs-CRP含量高于模型组(P<0.05);冠心宁片高剂量+LiCl组MCP-1、hs-CRP含量高于冠心宁片高剂量组(P<0.05)(表2)。

表2 各组大鼠血清中MCP-1、hs-CRP含量比较

2.3 冠心宁片对各组大鼠血清中ox-LDL、MDA含量的影响

模型组ox-LDL、MDA含量高于对照组(P<0.05);冠心宁片低、中、高剂量组以及阿托伐他汀组ox-LDL、MDA含量低于模型组,且冠心宁片呈剂量依赖性(P<0.05);LiCl组ox-LDL、MDA含量高于模型组(P<0.05);冠心宁片高剂量+LiCl组ox-LDL、MDA含量高于冠心宁片高剂量组(P<0.05)(表3)。

表3 各组大鼠血清中ox-LDL、MDA含量比较

2.4 冠心宁片对各组大鼠颈总动脉病理变化的影响

对照组大鼠动脉内壁光滑,无斑块形成;模型组大鼠动脉管内壁可见大量斑块附着;与模型组比较,冠心宁片低、中、高剂量组、阿托伐他汀组斑块总面积/动脉总面积减小,且冠心宁片呈剂量依赖性(P<0.05);LiCl组斑块总面积/动脉总面积高于模型组(P<0.05);冠心宁片高剂量+LiCl组斑块总面积/动脉总面积高于冠心宁片高剂量组(P<0.05)(图1,表4)。

Arrows indicate plaques.

表4 各组大鼠斑块总面积/动脉总面积比较

2.5 冠心宁片对各组大鼠颈总动脉中MMP-9蛋白及Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达的影响

模型组Wnt3a、MMP-9、β-catenin蛋白表达高于对照组(P<0.05);冠心宁片低、中、高剂量组以及阿托伐他汀组颈总动脉中Wnt3a、MMP-9、β-catenin蛋白表达低于模型组,且冠心宁片呈剂量依赖性(P<0.055);LiCl组Wnt3a、MMP-9、β-catenin蛋白表达高于模型组(P<0.05);冠心宁片高剂量+LiCl组颈总动脉中Wnt3a、MMP-9、β-catenin蛋白表达高于冠心宁片高剂量组(P<0.05)(图2,表5)。

A.control; B.model; C.Guanxinning tablets (150 mg/kg); D.Guanxinning tablets (300 mg/kg); E.Guanxinning tablets (600 mg/kg); F.atorvastatin; G.LiCl; H.Guanxinning tablets (600 mg/kg)+LiCl.

表5 各组大鼠颈总动脉中MMP-9、Wnt3a、β-catenin蛋白表达比较

3 讨论

动脉粥样硬化斑块是由动脉内膜内脂质沉积、炎性因子激活和氧化应激增强而形成的。据报道,动脉粥样硬化中的血脂异常以HDL降低和TG、TC和LDL升高为特征[9]。在斑块破裂阶段,MCP-1通过增厚内膜等过程促进动脉粥样硬化斑块进展[10];降低炎性因子hs-CRP含量可抑制ApoE(-/-)小鼠的动脉粥样硬化斑块进展[11];活性氧能够氧化和修饰ox-LDL,进而促进血管内皮细胞增殖及动脉粥样硬化斑块形成[12];MMP-9可调节细胞外基质的胶原蛋白降解,其表达和活性与斑块进展和随之而来的心血管并发症事件密切相关[13]。本研究显示,与对照组比较,模型组大鼠血清中TG、TC、LDL含量、MCP-1、hs-CRP含量、ox-LDL、MDA含量升高,HDL含量降低,大鼠颈总动脉中MMP-9蛋白表达升高,大鼠斑块总面积/动脉总面积增大,表明血脂异常、氧化应激及炎性反应参与了大鼠动脉粥样硬化斑块的形成。

冠心宁片是由丹参、川芎构成的一种植物药,据报道,冠心宁片可减轻西藏小型猪冠状动脉粥样硬化[14]。本研究显示,冠心宁片可呈剂量依赖性地抑制动脉粥样硬化斑块大鼠氧化应激及炎性反应,提示冠心宁片可能成为治疗动脉粥样硬化斑块的潜在有效药物。Wnt/β-catenin信号通路的紊乱经常会导致各种严重疾病,抑制Wnt/β-catenin信号通路可改善大鼠动脉粥样硬化[15]。本研究发现,与模型组比较,LiCl组大鼠颈总动脉中Wnt3a、β-catenin蛋白表达升高,大鼠斑块总面积/动脉总面积增大,氧化应激及炎性反应增强,且LiCl为Wnt/β-catenin信号通路激活剂,表明Wnt/β-catenin信号通路确实参与了大鼠动脉粥样硬化斑块的形成。此外,冠心宁片可下调模型大鼠颈总动脉中β-catenin、Wnt3a蛋白表达,且下调作用呈剂量依赖性,这就促使研究者猜测冠心宁片抑制大鼠动脉粥样硬化斑块的形成的机制可能与阻断Wnt/β-catenin通路有关。为了探究上述猜想是否与实际情况一致,本实验用高剂量冠心宁片和Wnt/β-catenin通路激活剂LiCl同时处理模型大鼠,结果显示,LiCl逆转了高剂量冠心宁片对模型大鼠氧化应激及炎性反应的抑制作用。

综上所述,冠心宁片影响大鼠动脉粥样硬化斑块形成的机制可能与调控Wnt/β-catenin通路有关。