SNP芯片评估欧拉藏羊群体遗传多样性和遗传结构

王志武，孙锐锋，赵 鹏，郭宏宇，王 婷

（山西农业大学动物科学学院，太原 030032）

欧拉藏羊产于四川、青海、甘肃三省交界处，是青藏高原特有的品种，以放牧为主，具有较强的抗逆性。欧拉藏羊体格高，体重大，肉质性能好，对高寒草原的低气压、严寒、潮湿等自然条件和四季放牧、常年露营的放牧管理方式能够很好地适应。欧拉藏羊头稍长，呈锐三角形，鼻梁隆起，公母羊大多数都有角，角形呈微螺旋状向左右平伸或略向前，尖端向外。四肢高而端正，腰背宽平，胸、臀部发育良好，尾呈扁锥形，尾长13～20 cm，公羊前胸多着生粗硬的黄褐色“胸毛”。欧拉藏羊生长发育快，育肥性能较好，屠宰率和净肉率高，肉质好，膻味轻，能量、蛋白质含量高，脂肪和胆固醇含量低［1］。6 月龄欧拉藏羊公羔体重在35 kg 以上，母羔体重在31 kg 以上；1.5 岁公羊体重在55 kg 以上，母羊体重在42 kg以上。繁殖率为100%。欧拉藏羊具有较好的产肉性能和抗病能力，是肉羊杂交组合中较好的父本品种，在生产实践中值得应用和推广。

为了解决山西省饲养肉羊生产性能低、核心竞争力弱的问题，山西省农业科学院畜牧兽医研究所羊产业技术团队根据国内外羊产业发展趋势和山西省自然生态条件，通过查阅资料和实地调研，选择产于甘肃玛曲县的采食能力强、肉质好、适应性强的肉用绵羊品种——欧拉藏羊（被称藏羊之王），与山西省大量养殖的小尾寒羊进行二元杂交，生产出繁殖率高、适应性强、尾巴小的杂交二代。为了评估引进欧拉藏羊的遗传结构和遗传多样性，本研究利用SNP 芯片技术检测了从甘肃省玛曲县引进的45 只欧拉藏羊群体的遗传多样性、亲缘关系及家系结构，为充分利用欧拉藏羊遗传资源，建立适应山西省饲养的肉羊杂交模式，培育生长发育快、繁殖率高、适应性强的肉羊新品系奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验中欧拉藏羊来源于甘肃省玛曲县欧拉乡畜合隆国家级农牧民专业合作社。在同等饲养条件下，共选择1 岁左右的种羊45 只，其中20 只公羊、25 只母羊，采集静脉血液于EDTA抗凝管中，-80℃保存备用。

1.2 欧拉藏羊DNA提取和检测

在北京康普森生物技术有限公司采用磁珠法进行DNA 的提取，使用康为世纪的CWE9600 Magbead Blood DNA Kit 试剂盒，基于硅基磁珠特异性吸附DNA的原理，用酶解法释放血液基因组，在特定高效裂解缓冲体系中结合DNA 分子，改变环境离子强度，从而实现基因组DNA 分离纯化。在2.0 mL 的裂解管中加入适量的血液样本，并加入ProteinaseK 和BufferWL，放入涡旋混匀振荡器振荡30 s，56℃恒温水浴锅裂解40 min，每隔20 min 振荡1 次，裂解完成后放入离心机进行瞬时离心，加入Lysate、BufferKL、MagbeadsPN 溶液，将SpintipsPack（磁棒套）插入96DW 深孔板中，运行DNA提取程序，进行gDNA 提取。采用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，判定DNA是否有降解。

1.3 欧拉藏羊DNA基因组分型

在北京康普森农业科技有限公司采用Infinium TM Ovine SNP50K Genotyping Array V3 芯片进行欧拉藏羊DNA基因组的测序和分型。

1.4 SNP芯片数据质控

为了保证分析的准确性，首先使用Plink（V1.90）软件检查重复样本，重复样本判定标准如下：当样本间DST≥0.99 时，判断为重复样本。DST 为两个个体在基因组水平上体现同态的概率。本次分析未发现重复样本。其次对样本的检出率进行质控，其质控标准与李隐侠等［2］报道一致。本次分析未发现检出率低于90%的样本，质控后剩余20 只公羊和25 只母羊进行后续分析。

1.5 欧拉藏羊群体的PCA分析

利用Plink（V1.90）进行PCA分析［3］，从聚类情况图可以了解藏羊群体的遗传结构。个体羊的遗传关系越近，在PCA 图上显示的直线距离就越近；反之，个体羊的遗传关系越远，显示的直线距离就越远。公羊样本用较大的红色圆点标注出来。

1.6 欧拉藏羊群体的近交系数分析

通过计算欧拉藏羊群体基因组上的纯合片段长度来进行近交系数分析，一般纯合片段长度越长，表明群体家系内可能存在近交，纯合片段长度越短，表明家系内亲缘关系较远，近交的可能性就越小。

1.7 欧拉藏羊群体遗传距离与亲缘关系分析

欧拉藏羊群体的遗传距离和亲缘关系分析与李隐侠等［2］报道的方法相同。本试验使用GCTA（V1.94）软件，计算个体间的亲缘关系系数。

1.8 欧拉藏羊群体的聚类分析

主要使用对接法和参考遗传距离矩阵对个体进行聚类分析，聚合为关系密切的和关系相对疏远的2 个分类单元，最后把分类后的个体组成系谱图，就能看到欧拉藏羊个体间的亲疏关系［3］。

1.9 欧拉藏羊群体的家系构建分析

采用MegaX（V10.0）软件对质控后的SNP 位点进行分析，采用邻接法构建群体进化树，分析欧拉藏羊群体的种公羊家系结构，计算种公羊在不同家系中的分布［4］。

2 结果与分析

2.1 欧拉藏羊DNA提取

欧拉藏羊群体的DNA 样品提取后，经检测可知平均浓度≥50 ng/μL。同时经1%琼脂糖凝胶电泳后，发现其基因组DNA 条带清晰，满足芯片检测要求，符合后期的试验研究条件。

2.2 基因组DNA的基因分型和质控检测

基因组DNA 的SNA 基因分型和质控检测结果表明（表1 和图1），欧拉藏羊群体的标记总数为64 734个，说明欧拉藏羊的SNP位点分析可以用50K 芯片；质控后标记总数变为57 066个，其中最多的6 170个位点分布在1 号染色体上，最少的830 个位点分布在24 号染色体上。

图1 质控前后的SNP在各染色体上的分布

表1 SNP质量控制结果

2.3 欧拉藏羊群体的PCA分析

利用Plink（V1.90）进行成分分析，以图的形式展示个体的聚类情况，公羊样本用较大的红色圆点标注出来。从图2 可知，25 只母羊与15 只公羊的直线距离较远，个体间遗传关系也较远；25只母羊与5只公羊的直线距离较近，个体的遗传关系也较近。20 只公羊可以分为5 个聚类。其中8 只公羊的遗传关系较近，为1个聚类；5 只公羊的遗传关系较近，为1 个聚类；3 只公羊的遗传关系较近，为1 个聚类；2 只公羊的遗传关系较近，为1个聚类；另外2只公羊的遗传关系也较近，为1个聚类。

图2 PCA可视化结果

2.4 欧拉藏羊群体的近交系数分析

个体中ROH 片段的总长度占常染色体基因组总长的比例为ROH 的近交系数。个体中ROH 的总长越长或数量越多，该个体的近交系数就越高。从欧拉藏羊群体基于ROH 的近交系数FROH的分布图3 可知，近交系数在0～0.05 之间的个体数目较多，且群体的平均近交系数值为0.034，说明群体的近交程度较低。

图3 基于ROH的近交系数FROH的分布

2.5 欧拉藏羊群体亲缘关系分析

2.5.1 基于G矩阵的亲缘关系分析

使用全基因组标记构建的基因组关系矩阵能更真实地反映个体间的亲缘关系，它比单纯根据系谱信息计算的亲缘关系更加准确，且更接近实际情况。基因组亲缘关系分析可视化结果图能够展示两两个体间基因的血缘关系，颜色越接近紫色表示亲缘关系越近。从欧拉藏羊群体亲缘关系图4 可以看出，欧拉藏羊群体的亲缘关系均较远。

图4 基因组亲缘关系分析可视化结果

2.5.2 遗传距离分析

从图5 可知，45 只欧拉藏羊之间的IBS 遗传距离在0.211 1～0.309 7之间，平均遗传距离为0.278 9；20只公羊间的遗传距离在0.211 1～0.307 5 之间，平均遗传距离0.261 6。说明欧拉藏羊群体的遗传距离较远，近交风险较低。

图5 遗传距离分析可视化结果

2.6 聚类分析

通过对欧拉藏羊个体进行系谱图分析，可知欧拉藏羊群体共有8 个家系。欧拉藏羊群体公羊样本聚类分析结果见图6。

图6 公羊样本聚类分析结果

2.7 家系构建分析

由图7 可知，欧拉藏羊种公羊可以划分为8 个家系，家系1 包含9 只公羊，家系2 包含2 只公羊，家系7包含4只公羊，其余家系均为1只公羊。根据现有母羊与公羊之间的亲缘关系划分为8 个不同家系，其中25只母羊与公羊的血缘关系均较远，分类为其他，育种时可以作为参考。

图7 所有公母羊样本聚类分析结果

3 讨论

在育种工作中，遗传距离可以表示不同种群或个体间的基因差异程度，具有指导亲本选育的重要作用。本试验通过对欧拉藏羊之间的IBS 遗传距离的分析，揭示了个体间的亲缘关系。结果表明，欧拉藏羊群体的遗传距离在0.211 1～0.309 7 之间，平均遗传距离为0.278 9；20 只公羊间的遗传距离在0.211 1～0.307 5 之间，平均遗传距离为0.261 6。说明欧拉藏羊种公羊和母羊之间具有适中的遗传距离［5-6］。根据亲缘关系小于0.1的标准，将种公羊划分为8个家系，其中有5个家系分别只有1 只公羊，需要进行扩繁选育，维持血统的完整。25 只母羊与所有公羊的亲缘关系系数均小于0.1，可与任何1只公羊进行配种。

群体的近交系数是表示动物群体近交程度的一个指数。从本试验可知，欧拉藏羊群体的平均近交系数为0.034，近交程度较低。因此，为降低群体的近交增量，避免欧拉藏羊生产性能的下降，建议在同一家系内公母羊尽量不要互相配种，参考欧拉藏羊的家系构建和亲缘关系分析结果，确认亲缘系数后，进行合理的配种。在生产管理中要做好配种记录，完善系谱档案，避免因配种计划的错误而导致近亲交配，同时加强对欧拉藏羊的选育提高，进一步保障藏羊群体的遗传多样性，从而提高其品种资源利用率。

4 结论

本试验利用SNP 50K 芯片对欧拉藏羊群体的遗传多样性和遗传结构进行了分析，发现欧拉藏羊群体的遗传多样性较丰富，群体内近交程度较低，共有8 个家系，其中有5 个家系种公羊数量少。需要加强后代的选育和扩繁，防止血统流失，从而提高欧拉藏羊品种资源的有效利用。