罗伊氏乳杆菌富集有机硒转化条件的研究

陈永旭，孔庆辉，穷达卓玛，田发益

（西藏农牧学院动物科学学院，林芝 860000）

硒元素在自然界中以有机态和无机态的形式存在，是机体所必需的微量元素［1］，硒能够增强机体的免疫力，并具有抗癌、抗氧化作用［2］。其中无机硒有毒性作用且难以吸收，而有机硒或零价态的单质硒相对于无机硒来说有着较高的吸收利用率［3-5］。目前有两种途径合成有机硒，一种是人工合成，另一种是生物转化。但由于人工合成的成本高、生产工艺复杂，且吸收利用率低，在实际生产中容易受到限制，而生物转化法合成工艺简单、成本低廉且转化率相对较高。运用生物转化法把无机硒转化为有机硒后，可使其毒性降低并能显著激发免疫反应，是一条安全有效的途径［6］。因此，很多研究者选择利用微生物的富集作用来合成有机硒。

动物机体摄入无机硒后，能被组织吸收利用转化为多种不同功能形式的有机硒。王菲［7］的研究表明，吸收利用的硒主要以硒蛋白的形式存在于机体内，而多数硒蛋白是由硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸组成的。Verma 等［8］从动物的组织和器官中检测出13 种含硒蛋白，其中硒蛋白M 可参与调节体重和能量代谢。硒蛋白P还原能力很强，能够清除机体内的自由基，保护肝脏免受坏死和脂质过氧化［9］。在细菌培养物中也发现了多种含硒酶：硫解酶、甘氨酸还原酶和黄嘌呤脱氢酶等，其中谷胱甘肽过氧化物酶能降低细胞中的H2O2，减少血液及肠道中的过氧化物［10-13］。由此可见，硒蛋白对机体调节有一定的帮助。目前，在微生物富集转化无机硒的研究中，酵母通常作为首选载体［14］。但研究表明，用酵母富集转化硒时，主要产生硒代蛋氨酸（SeMet），其会非特异性地结合到蛋白质中。多种研究发现，乳酸杆菌能将硒转化为硒代半胱氨酸，可作为一种有机硒源用于富有机硒动物饲料添加剂使用。

罗伊氏乳杆菌属于厚壁菌门（Firmicutes），芽孢杆菌纲（Bacilli），乳杆菌目（Lactobacillales），乳杆菌科（Lactobacillaceae），乳杆菌属（Lactobacillus），是革兰阳性菌，是一种过氧化氢酶阴性、不运动、不产芽孢、专性异型发酵细菌［15］。研究表明，罗伊氏乳杆菌几乎在任何脊椎动物和哺乳动物的肠道内都能被发现，其耐酸、耐胆盐，可通过口服到达小肠内并黏附在小肠壁，是具有益生功效的肠道益生菌［16］。罗伊氏乳杆菌能够转化甘油并产生罗伊氏菌素（Reuterin），大多数乳酸菌分泌的细菌素或类细菌素，仅对种属相近的部分细菌起抑制作用，而罗伊氏菌素是一种天然的广谱抑菌物质，由环状二聚物、3-羟基丙醛的单体和水合物混合组成，在水溶液中存在动态平衡［17］。罗伊氏菌素可以有效抑制革兰阳性菌、阴性菌以及霉菌的生长［18］，能作为细菌抑制剂［19］。用罗伊氏乳杆菌转化无机硒，可在一定程度上保障富集有机硒产品的安全性［20］。

罗伊氏乳杆菌能够把无机硒转化为有机硒，从而降低硒的毒性，提高硒的利用率；罗伊氏乳杆菌是益生菌，它产生的罗伊氏菌素是天然广谱抑菌物质，能改善消化道的微环境。本研究以罗伊氏乳杆菌为介质，通过筛选其对硒的耐受性和最高转化力，以期为富有机硒饲料添加剂产品的规模化开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

罗伊氏乳杆菌，由西藏农牧学院动物营养与饲料实验室从藏猪消化道内分离并鉴定。

1.2 改良的MRS培养基

组成成分：大豆蛋白胨114.67 g、酵母浸粉38.22 g、麦芽糖5.06 g、磷酸氢二钾2.0 g、葡萄糖10.13 g、红糖20.25 g、乙酸钠7.5 g、蜂蜜5 mL、七水硫酸镁0.098 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、硫酸锰0.03 g、吐温-80 1 mL、琼脂粉（用于固体培养）15.0 g、无菌蒸馏水1 000 mL。配置好后，121℃高压灭菌30 min。

主要的优化改良措施：氮源改用大豆蛋白胨，并增加了用量，去除了牛肉粉；碳源增加了麦芽糖、红糖及蜂蜜，减少了葡萄糖的用量。

1.3 仪器及试剂

UV-5200 型紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；SF-CJ 垂直单向流双人净化工作台，郑州南北仪器设备有限公司；TOMY SX-500 自动灭菌锅，日本Tomy Digital Biology 公司；Eppendorf 5810R高速冷冻离心机，艾本德（上海）国际贸易有限公司。

亚硒酸钠，乙二胺四乙酸二钠，3，3’-二氨基联苯胺（3，3’-DAB），甲苯，甲酸，氢氧化钠，以上试剂均为分析纯。

1.4 试验方法

1.4.1 罗伊氏乳杆菌富有机硒培养

参照张雪梅［21］、Krzywonos 等［22］及Elsayed 等［23］的方法，对培养基中葡萄糖、蛋白胨等主要成分进行优化，来提高菌体质量及有机硒转化率。为提高菌种活力，将置于低温冰柜的罗伊氏乳杆菌放到40～50℃水浴中解冻，并接种至改良的MRS 液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24 h，连续活化3代，作为菌种。将亚硒酸钠分别加入到灭菌过的MRS 培养液中，制成不同质量浓度（0、20、40、60、80、100、120 μg/mL）的含硒MRS 培养液。将对数期的罗伊氏乳杆菌按1%的接种量，接入各个不同质量浓度的亚硒酸钠MRS 培养液中，设置摇床温度为37℃，培养24 h。5 000 r/min 离心10 min，记录菌落颜色，将不同浓度的亚硒酸钠菌液，用漩涡振荡器混匀后，进行MRS 琼脂平板涂布，每组3个重复，最后计算菌落数。

1.4.2 标准溶液的配制

首先配制6 μg/mL的硒标准溶液，5 g/100 mL EDTA-2Na 溶液和0.5%3，3’-二氨基联苯胺溶液。然后准确吸取0，1，2，3，4，5 mL分别加到50 mL的容量瓶中，加蒸馏水至10 mL，再加入1 mL 配制好的EDTA-2Na溶液，振荡摇匀后，滴加盐酸调节pH 值至2～3，再各加4 mL 0.5% DAB 溶液，振荡摇匀，置于暗处反应30～50 min。反应时间结束后，用10%NaOH 调节pH值至6～7，再加入6 mL 甲苯充分振荡，然后静置，等明显分层后，吸取甲苯层加到比色皿中，设置紫外分光光度计的波长为420 nm，测量吸光度，绘制标准曲线。

1.4.3 罗伊氏乳杆菌富有机硒转化效率的测定

将培养24 h 后的不同质量浓度的亚硒酸钠MRS培养基，5 000 r/min 离心15 min，收集菌体并用pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次。采用硝酸-高氯酸混合液湿法消化。在5 mL 的混合液中过夜，然后在80℃的温度下加热，直到液体澄清，使各形态的硒转化为硒单质，即可进行硒含量测定。

采用3，3’-二氨基联苯胺分光光度法检测硒含量。首先，硒与3，3’-DAB 在酸性条件下会生成黄色苤硒脑络合物；其次，在中性环境下形成的络合物，加入甲苯可以很好地把硒元素萃取出来［24-25］，这时在420 nm 处能测量出较好的吸光度；最后，通过标准曲线即可算出硒浓度。

1.4.4 有机硒转化率的计算

有机硒转化率=菌体中有机硒的含量/加入的硒总量。

1.4.5 有机硒转化量的计算

有机硒转化量（μg/g）=菌体内有机硒的含量/细菌的干质量。

1.5 数据处理

采用SPSS 26.0 进行数据的差异显著性分析，结果以平均数±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

利用UV-5200 型紫外分光光度计在420 nm 处测亚硒酸钠标准溶液的吸光度。以亚硒酸钠浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。如图1 所示，标准曲线的回归方程为Y=0.053 5X-0.003 8，决定系数R2=0.998 1。

图1 标准曲线绘制

2.2 不同硒浓度对罗伊氏乳杆菌的影响

由表1 可知，亚硒酸钠的质量浓度小于60 μg/mL时，菌落数变化较小，菌体颜色为乳白色，此时无机硒未对罗伊氏乳杆菌产生毒性作用、菌体正常吸收转化无机硒。当亚硒酸钠的浓度大于80 μg/mL 时，菌落数明显减少，菌落颜色开始变为红色。无机硒对罗伊氏乳杆菌产生毒性作用，抑制了菌体的生长，罗伊氏乳杆菌通过自身的调节，把亚硒酸钠转化为红色的单质硒析出菌体表面，降低毒性作用。当亚硒酸钠的浓度为100 μg/mL 时，与其他各处理组均出现极显著差异（P＜0.01），此时亚硒酸钠的转化量最高。

表1 不同硒浓度对罗伊氏乳杆菌的影响

当亚硒酸钠浓度小于80 μg/mL 时，随着亚硒酸钠浓度的升高，每克菌体转化硒的量也逐渐增加；当亚硒酸钠浓度为100 μg/mL 时，硒转化量达到最高，为4.40 mg；当亚硒酸钠浓度在120 μg/mL 时，菌体自身对无机硒的调节能力达到上限，无机硒对菌体的毒性作用增强，罗伊氏乳杆菌增殖能力下降，转化硒的能力减弱。

由图2 可知，当亚硒酸钠浓度小于80 μg/mL 时，每克菌体对亚硒酸钠的转化效率略有上升趋势，但无显著变化，说明罗伊氏菌在此亚硒酸钠浓度范围内合成的硒蛋白保持稳定状态。当亚硒酸钠浓度达100 μg/mL时，亚硒酸钠的转化效率最高，达13.3%，说明随着菌体内硒蛋白合成量的增加，促进了罗伊氏乳杆菌的增殖。但在亚硒酸钠浓度为120 μg/mL 时，亚硒酸钠对罗伊氏乳杆菌的毒性效果增强，转化效率反而低于浓度为100 μg/mL时。

图2 不同亚硒酸钠浓度对菌体转化硒效率的影响

3 讨论

本试验富集有机硒所用的罗伊氏乳杆菌为益生菌，它普遍分布在动物的肠道内，并且对肠黏膜有着很强的黏附力，能够改善肠道菌群分布，抑制有害菌定植，减少微生物从肠腔到肠外组织的转移，加强肠道物理屏障，也可通过产生抗菌分子，抑制病原微生物的定植，还可通过重塑宿主肠道中的微生物群组成减少促炎因子的产生、促进调节性T 细胞的发育，进而保护宿主的肠道免疫系统［26］。Chen 等［27］认为，罗伊氏乳杆菌产生的主要抗菌因子是罗伊氏菌素（Reuterin），其主要是一个由3-羟基丙醛（3-hydroxypropionaldehyde，简称3-HPA）的单体、水合物和环化二聚体组成的混合物，是一种广谱抗菌的非蛋白质类物质，能广泛抑制革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌和病原虫等的生长。罗伊氏乳杆菌是当前微生物中产罗伊氏菌素较强并且耐受力最高的菌种，作为益生菌，它产生的罗伊氏菌素也对机体肠道健康有很大益处。

为了提高罗伊氏乳杆菌的活菌数，本试验借鉴了张雪梅等［21］对罗伊氏乳杆菌优化后的营养物质成分和培养条件，对MRS 培养基进行了改良，以提高菌体质量和单位体积内对有机硒的转化量。由本试验结果可知，当亚硒酸钠的浓度高于80 μg/mL 时，菌体开始出现红色，并且亚硒酸钠的浓度越高，颜色越深。有研究指出，乳酸菌可通过自身调节化解硒的毒性，除了将富集的一部分硒转化为各种形态的有机硒外，还会将另一部分还原成零价态的单质硒，即溶液中的红色物质为单质硒［28］。孙会轻等［29］通过对古尼虫草的富硒研究发现，培养过程中，硒浓度大于7 μg/mL时，古尼虫草对硒的富集作用会转为病理性，对生物量和富集硒的转化效率都会极显著下降。刘韫涛等［30］的试验证明，真菌在硒浓度高于200 μg/mL 时，自身会产生毒性，影响生长。所以当菌体变红时，说明有单质硒转化出来，但同时也会伴随着有机硒的转化。因此，要在硒添加量和转化量之间找到平衡。本试验结果表明，菌株的最适亚硒酸钠浓度为100 μg/mL，此时罗伊氏乳杆菌转化的有机硒量最高，达4.40 mg/g。

动物体内的硒大部分以含硒酶和含硒蛋白两种形式存在，硒的摄入能显著上调细胞中基因SELO、SELP、SELES、SELT、SELW、Gpx2、TrxR1 和Sep15 等多种硒蛋白的表达，从而增强免疫细胞治疗的抗肿瘤效果。硒酶中的磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPx），是机体内重要的过氧化物分解酶，属于膜结合酶，发挥作用的方式是抑制膜磷脂的过氧化反应。另外，硒蛋白中的硒蛋白I 能够参与磷脂生物合成，而硒蛋白O 含有基础序列的线粒体蛋白，是氧化还原功能的基础模板。目前研究发现的有机硒，它们均对机体有正向调节作用。通过罗伊氏乳杆菌对硒的富集作用，使得硒的摄入变得安全、有效。本试验后续还对富集有机硒的罗伊氏乳杆菌进行了安全性验证，每天给兔子饲喂其最大的硒耐受量，最终确定了此浓度下培养出的富有机硒罗伊氏乳杆菌，不会对兔子的健康产生不良影响。本研究组目前正对牦牛进行安全性试验，从2023 年8 月至10 月期间，牦牛生长良好，没有出现消化道疾病等，试验还在持续进行中。

本试验主要是对罗伊氏乳杆菌富集有机硒的能力进行了研究，对于罗伊氏乳杆菌所转化硒蛋白的种类，还有待进一步研究。

4 结论

通过本次试验发现，随着亚硒酸钠浓度的提高，罗伊氏乳杆菌的菌落逐渐减少，表明过高的亚硒酸钠浓度会抑制该菌的生长；当亚硒酸钠浓度大于80 μg/mL时，菌体颜色开始变红，开始析出单质硒，表明罗伊氏乳杆菌的转化能力达到峰值，且对硒有较高的耐受性，当亚硒酸钠培养浓度为100 μg/mL 时，有机硒转化量最大，达4.40 mg/g，转化率最高，为13.3%。