安徽新安江水牛mtDNA D-Loop区遗传多样性与系统进化研究

赵拴平，金 海，刘 峻，李永胜，金 磊，李 倩，徐 磊，贾玉堂

（1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，畜禽产品安全工程安徽省重点实验室，合肥 230031；2.休宁县畜牧兽医技术推广站，休宁 245000；3.黄山市畜牧兽医推广中心，黄山 245700）

自古以来，我国南方是水稻的主要种植区，水牛作为役畜在其生产中发挥了重要的作用。在系统分类学中，水牛分为亚洲水牛和非洲水牛，亚洲水牛根据其外貌、习性、生产性能等的不同，进一步分为沼泽型水牛和江河型水牛。新安江水牛属役用及役肉兼用型，主要分布于安徽省沿新安江上游地区的休宁县、歙县、徽州区等地。当地地貌类型多样，平原、岗地、丘陵和山地俱全，是安徽省内水热带最优越的区域，适合水牛生长，而且其独特隔绝的自然环境避免了新安江水牛与其他品种之间发生交流。新安江水牛耐粗放、适应性强、役用性能强，善于行走。

线粒体DNA（mtDNA）遵循母系遗传特性，其控制区D-Loop 序列变异速率为其他片段的5～10 倍，且不易发生基因重组，在家畜起源进化和群体遗传多样性等研究中有广泛的应用。研究发现，沼泽型水牛和江河型水牛不仅在形态学［1］、细胞学［2-3］和蛋白质多态性［4-5］上存在较大的差异，而且有较远的遗传距离［6］。Ting 等［7］通过分析25 个沼泽型水牛和江河型水牛品种的121 个全基因组，发现沼泽型水牛和江河型水牛的祖先在大约23 万年前分化，然后经历了独立的驯化过程。Lei 等［8-9］研究发现，中国本地水牛品种具有丰富的遗传多样性，中国沼泽型水牛具有两条线粒体DNA 谱系，有2 个母系起源。Yue 等［10］通过对中国本地沼泽型水牛和江河型水牛mtDNA D-loop 区的研究，发现大部分的中国沼泽型水牛属于A 支系，且A 支系很有可能在中国西南部驯化而成。亐开兴等［11］和张自芳等［12］通过研究滇东南水牛的D-Loop区，发现滇东南水牛属于沼泽型水牛，存在2 个母系血统来源，受河流型水牛基因渗入较小。卢永芳等［13］和赵拴平等［14］通过分析安徽地区江淮水牛和东流水牛的D-Loop 区，发现江淮水牛和东流水牛遗传多样性丰富，且具有2 个线粒体母系来源。本研究通过分析28 条安徽新安江水牛的线粒体DNA D-Loop序列和693 条中国其他地方水牛的D-Loop 序列，探索新安江水牛群体的遗传多态性和系统进化关系，以期为中国地方水牛种质资源保护和创新利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

在安徽省黄山市休宁县、徽州区等新安江水牛主产区，选择28 头25～36 月龄、无亲缘关系的水牛个体，颈静脉每头采血10 mL，ACD 抗凝，低温带回实验室冻存于-80℃冰箱中。同时从GenBank 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）下载24 个中国地方水牛群体693 条D-Loop 序列数据，合计25 个地方品种共721份样本（表1）。

表1 中国25个地方水牛群体遗传多样性比较

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

利用天根生化科技有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒提取新安江水牛的全基因组，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测DNA 完整性，将检测合格的DNA样品使用双蒸水稀释至50 ng/μL冷藏备用。

1.2.2 PCR扩增和测序

新安江水牛mtDNA D-Loop 全序列利用引物DLoop-F：5'-TAGTGCTAATACCAACGGCC-3'和D-Loop-R：5'-AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3'［15］进行扩增。PCR反应体系25 μL，包括1 μL DNA，12.5 μL 2×Taq PCR Mix 缓冲液，正反向引物各1 μL（100 ng/μL）和去离子水。扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，32 个循环；72℃总延伸5 min。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，阳性产物进行纯化与回收后委托上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.3 数据分析

利用DNASTAR 5.0 和Clustal X 软件分析校对测序获得的新安江水牛mtDNA D-Loop 区序列，利用DnaSP 5.10软件［16］统计变异位点数、单倍型数、核苷酸多样性和单倍型多样性，利用MEGA 11.0.13 软件［17］分析多态位点，构建Neighbor-joining 系统发生树，利用Network10.2.0.0［18］软件构建Media-joining网络。

2 结果与分析

2.1 新安江水牛mtDNA D-Loop区遗传变异分析

由表1可知，安徽新安江水牛的mtDNA D-Loop 区完整序列长度为926～933 bp，28 个新安江水牛群体中共存在117个变异位点，构成25种单倍型，其中共有单倍型包括Hap5 和Hap7，Hap5 频率最大（10.7%，3/28），其他单倍型均为不同个体所特有。新安江水牛mtDNA D-Loop 区核苷酸多样性为0.989±0.014，单倍型多样性为0.026 02±0.003 03，说明其遗传多样性丰富。

中国25 个地方水牛群体的721 条mtDNA D-Loop序列共存在226 个变异位点，构成了224 个单倍型，核苷酸多样性为0.018 15±0.002 42，单倍型多样性为0.883±0.011，其中18 个单倍型在新安江水牛群体首次发现。新安江水牛群体单倍型多样性和核苷酸多样性与其他水牛群体无显著差异，其群体遗传多样性与其他水牛群体接近。

2.2 新安江水牛群体mtDNA D-Loop 区的系统进化树分析

利用新安江水牛群体构建Neighbor-joining 系统发生树，结果如图1所示，25个单倍型分为A、B两个大的支系，A 支系由21 个单倍型构成，代表24 个水牛个体，占总水牛群体的85.71%（24/28），B支系由4个单倍型构成，代表4 个水牛个体，说明新安江水牛具有A 支系和B支系2个母系来源，其中A支系占据主导地位。

2.3 基于mtDNA D-Loop 区的中国水牛群体的遗传距离和系统进化树分析

以肉牛（Bos taurus）（NC_006853）作为外群体参照，利用MEGA11.0.13 软件对获得的25 个水牛群体721 个mtDNA D-Loop 序列进行遗传距离分析，结果如表2 所示。新安江水牛与东流水牛、江淮水牛和峡江水牛的遗传距离最近，与广西水牛的遗传距离最远，为0.054。由图2可知，新安江水牛与中国其他地方水牛群体聚为一类，广西水牛单独聚为一类，可能与广西水牛群体在长期培育过程中，有江河型水牛基因渗入有关。

表2 中国25个地方水牛群体遗传距离

图2 25个中国地方水牛群体Neighbor-joining系统发生树

2.4 基于mtDNA D-Loop 单倍型间的Mediajoining进化网络分析

进化网络图（Network）能客观地描述物种内不同单倍型间的遗传进化关系，呈现物种的进化进程［19］。本研究利用DnaSP 5.10 和Network10.2.0.0 软件构建了721 条mtDNA D-Loop 序列224 个单倍型的网络图，结果如图3 所示。224 个单倍型分为A 和B 两个支系，A 支系呈现以单倍型Hap_15 和Hap_174 为中心，周围单倍型环绕的星状辐射结构；B 支系包含b1 和b2 两个亚支系，b1 支系以Hap_7 为中心，b2 支系以Hap_22 为中心，均呈现星状辐射结构。距离A 支系和B 支系较远的9个单倍型，代表广西水牛的16个个体。

图3 25个中国地方水牛群体线粒体D-Loop单倍型的Media-joining进化网络图

3 讨论

新安江水牛主要分布于安徽省沿新安江流域上游地区，主要产区为安徽省黄山市的休宁县、歙县、徽州区和祁门等地。南宋罗愿所著《新安志》记载，“水牛色苍而多力其角如环，所谓吴牛也”。安徽新安江流域雨水充沛，气候温和湿润，自古以来就有种植水稻的历史，山间水田面积小，交通不便，当地农民多饲养水牛用于耕田，水牛作为当地传统农业不可分割的一部分，饲养历史悠久。当地人们的传统思想认为，牛是财富的象征。

生物群体丰富的遗传多样性不仅有助于适应不同的生态环境，更是其可持续稳定发展的重要基石。核苷酸多样度和单倍型多样度是衡量群体遗传变异程度的重要指标，核苷酸多样度和单倍型多样度越高，群体的遗传变异程度越高。本研究通过分析28 头安徽新安江水牛mtDNA D-Loop 区的核苷酸变异，发现其群体中共存在117 个变异位点，核苷酸多样性为0.989±0.014，单倍型多样性为0.026 02±0.003 03；新安江水牛的单倍型多样性高于中国其他地方水牛品种，与东流水牛、江淮水牛、滨湖水牛和广西水牛较为接近；其核苷酸多样度低于滨湖水牛和广西水牛，高于其他地方水牛品种。说明新安江水牛线粒体D-Loop 区遗传变异率较高。系统进化树分析发现，新安江水牛具有2个母系来源（A支系和B支系），本研究结果与Lei等［8-9］所发现的中国水牛群体2 个母系遗传起源的观点一致。遗传进化分析发现，新安江水牛与东流水牛（安徽）、江淮水牛（安徽）和峡江水牛（江西）遗传距离最近，与广西水牛遗传距离最远。N-J 系统发生树显示，新安江水牛与中国其他地方水牛群体聚为一类，说明新安江水牛属于沼泽型水牛。进化网络图描述了25个水牛群体224 个单倍型的遗传进化关系，呈现A 支系以单倍型Hap_15 和Hap_174 为中心的星状辐射结构；亚支系b1 和b2 也具有星状结构的特征，预示着中国水牛经历了群体的扩张。距离A 支系和B 支系较远的9 个单倍型，代表广西水牛的16 个个体，与赵拴平等［14］报道的广西水牛具有江河型水牛血统的研究结果一致。

新安江水牛是安徽优良地方水牛品种之一，是我国丰富基因库的重要组成部分。本研究发现，新安江水牛属于沼泽型水牛。历史研究证明，沼泽型水牛在社会生产生活中主要用来役用，是水稻田耕作重要的劳动力［20］，与新安江流域自古以来就有种植水稻的历史相符合。近年来，对沼泽型水牛驯化地点和时间的研究仍然存在争议。Yue 等［10］研究认为，沼泽型水牛在中国西南地区驯化形成，而Colli 等［21］和Zhang 等［22］认为，沼泽型水牛在中国西南-东南亚边境和泰国北部地区驯化形成。据联合国粮食及农业组织2017 年数据统计，中国是世界3 个主要水牛饲养大国之一，共饲养水牛2 347 万头，占世界总头数的11.68%［23］。近年来，由于农业产业结构调整和农村劳动力的转移，机械逐渐取代了役用水牛，加之本土水牛缺乏完善的遗传资源保护和利用，我国面临着本土水牛种质资源退化，群体数量和质量大幅度下降的窘况。据统计，2022 年底具有种用价值的新安江水牛仅有4 129头。因此，迫切需要加大对新安江水牛的保护力度，应在保种的基础上加以开发利用。

4 结论

本试验研究了我国安徽新安江水牛群体线粒体D-Loop 区的遗传多样性及系统进化关系，证明新安江水牛属于沼泽型水牛，具有2个母系起源，其群体变异水平与中国其他地方水牛群体接近，且新安江水牛与我国其他地方水牛具有一定的遗传距离。