高粱两步法厌氧发酵产己酸研究

邓星成, 任志强,2, 曾 波, 卫春会,2, 邓 杰,2,谢 军,2, 黄治国,2,*

(1.四川轻化工大学 酿酒生物技术及应用四川省重点实验室, 四川 宜宾 644000;2.中国轻工业酿酒生物技术及智能制造重点实验室, 四川 宜宾 644000)

高粱[Sorghumbicolor(L.) Moench]是被子植物门(Angiospermae)百合纲(Liliopsida)莎草目(Cyperales)禾本科(Poaceae)黍亚科(Sub Fam. Panicoideae)高粱族(Trib. Andropogonea)高粱属(Sorghum)植物,一年生草本作物,籽粒为谷物类粮食。高粱是中国的古老作物之一。考古学家发现,远在西周至西汉时期高粱已在中国广泛分布,至今约有 4 000年的栽培历史。中国的琥珀甜高粱于1853年传入美国,曾对那里的糖高粱生产起过重要作用。现在世界热带和温带的90多个国家栽培高粱,主要的生产国有中国、美国、印度、阿根廷、墨西哥、尼日利亚、苏丹、澳大利亚等。高粱在中国的主产区集中在东北、华北和西北地区。高粱是我国重要的杂粮作物,其产量低于水稻、小麦、玉米、甘薯,居第五位。高粱是酿酒和制醋、饴糖、淀粉的主要原料之一。我国白酒生产多以高粱为主要原料,因此白酒也称为“高粱白酒”,高粱酒在清朝已经被公认为是最好的酒,流行于我国北方和部分南方地区。中国的茅台酒、汾酒、山西陈醋等均以高粱为原料。高粱经酸或酶水解后会产生大量的风味物质,这些风味物质会在酿酒生产时带入酒中[1]。

以高粱为酿酒原料的浓香型白酒中己酸不仅是重要的挥发性风味化合物,还是己酸乙酯合成的前体物质。己酸作为6个碳的中链脂肪酸,广泛用于食品添加剂、医药、香料等工业生产领域[2-3],具有较高的经济价值。同时,以微生物发酵己酸的研究中,发酵原料大多含有丰富的糖类物质,如餐厨垃圾、果蔬废弃物和纤维素等[4]。高粱具有抗旱、抗涝、耐盐碱、耐瘠薄、耐高温、耐寒冷等抗逆性,即使是在贫瘠的土地上仍能稳定生长,作为一种非口粮竞争性农作物,不会抢占粮食土地,且淀粉含量高,价格便宜。但高粱作为己酸发酵原料的研究目前还未见报道,本研究团队从优质窖泥中经富集、筛选产己酸相关的微生物得到己酸复合菌液,该菌液能利用底锅水、黄水等白酒酿造废液发酵己酸。

化学法主要是以硝酸氧化仲辛醇制得己酸,但副产物多,对环境污染较大;而微生物发酵方面,当前研究多利用玉米、小麦、甜高粱等淀粉质原料生产短链羧酸[5-6],这类酸相对分子质量较小,能量密度低,亲水性强,难分离[7],因而进一步的资源化利用受到限制,于是近年来利用产己酸微生物将短链脂肪酸转化为中链脂肪酸的研究得到了较多的关注。

实际微生物合成己酸是一个碳链延伸的过程,通过β氧化逆循环实现,在这个过程中发生了电子供体的氧化与电子受体的还原,常见电子供体有乙醇和乳酸,短链羧酸(丁酸、乙酸等)则作为电子受体[8]。因此,当前己酸的厌氧发酵也大多采用两步发酵的方式[9]。首先,因产己酸微生物难以直接利用大分子有机物,第一步先利用酸化类微生物分解大分子有机物产生丁酸和乙酸等短链脂肪酸作为电子受体。第二步利用产己酸微生物在电子供体作用下,将第一步中的短链脂肪酸经碳链延长转化为己酸[7]。将己酸发酵过程分为两步骤的同时,也将酸化类微生物和产己酸微生物进行空间隔离,这不仅可避免己酸和电子供体(乙醇)对酸化微生物的毒害,同时在不同发酵体系下,能更有效地控制两类微生物处于最佳的发酵条件,从而提高己酸的产量。而电子供体的来源可分为三大类[10],第一类为发酵底物自身富含电子供体,如酿造废水[11]、乳清液等;第二类为外源添加电子供体[12-13];第三类为利用有机底物通过微生物发酵自生电子供体,例如Contreras-Davila等[14]将食品垃圾经过同型乳酸发酵生成乳酸并结合连续生物反应器进行碳链延长,最终实现在无外源电子供体的条件下生成正己酸。但目前大部分的己酸发酵仍然依赖外加电子供体的方式以提高己酸产量[15],这导致己酸生产成本过高,通过原料自生电子供体,以强化己酸生成的研究还相对较少,值得进一步探索。

本研究在无外源添加电子供体条件下,探究以高粱为原料,采用两步法厌氧发酵产己酸的可行性。通过优化发酵时间、接种量、发酵温度等条件,以提高第一步中丁酸、乳酸、乙醇发酵液的转化率。然后以3种发酵液为底物进行发酵制备己酸,通过优化不同底物组合,以及乙醇发酵液和乳酸发酵液添加比例,以获得较优的己酸发酵条件。并分析较优条件下己酸发酵过程中的微生物与代谢物质相关性,探究己酸发酵机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高粱原料为市售粳高粱(粉碎至200目)。己酸复合菌液,山东中惠生物科技股份有限公司;糖化酶(5×104U/g)、α-淀粉酶(5×104U/g),江苏博立生物制品有限公司;酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),安琪酵母股份有限公司;嗜酸乳杆菌TYCA06(Lactobacillusacidophilus),安徽锦乔生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Auper Alcomat型高精度数显酒精浓度计,优莱博技术(北京)有限公司;1000A型多功能粉碎机,永康市红太阳机电有限公司;UV-1200型紫外分光光度计,上海美普达仪器有限公司;悟空K2025型高效液相色谱仪,海能未来技术集团股份有限公司;GC2200型气相色谱仪,云铂仪器(成都)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1两步法厌氧发酵己酸工艺流程

高粱经两步法厌氧发酵产己酸的工艺流程见图1。第一步是以高粱为原料分别接种己酸复合菌液、接种嗜酸乳杆菌TYCA06、添加酿酒酵母制得丁酸发酵液、乳酸发酵液、乙醇发酵液;第二步是将丁酸发酵液、乳酸发酵液、乙醇发酵液等3种发酵液混合,接种己酸复合菌液,制得己酸。

图1 高粱两步法厌氧发酵产己酸工艺流程Fig.1 Process of two-step anaerobic fermentation to produce caproic acid by sorghum

1.3.2第一步丁酸发酵液的发酵工艺条件优化

取10 g高粱粉,添加了所有发酵所需物(包括高粱粉、CaCO3、己酸复合菌液)后定容至100 mL;添加质量分数为1%的CaCO3(即1 g)。采用单因素优化法,分别考察发酵时间(1、3、5、7、9 d)、发酵温度(25、30、34、37、40 ℃)、己酸复合菌液接种量(5%、10%、15%、20%)(接种量为5%即菌液体积占总发酵体系体积的体积分数,下同)对高粱厌氧发酵产酸的影响。厌氧瓶有效容积100 mL,每组3次平行,定期取样检测发酵液中丁酸和乙酸质量浓度,并计算相应淀粉转化率。

淀粉转化率的计算方法见式(1)。

(1)

式(1)中,162为淀粉相对分子质量;88为丁酸相对分子质量;120为2 mol乙酸相对分子质量;实际淀粉消耗量为发酵前后淀粉质量分数的差值。

1.3.3第一步乳酸发酵液的发酵工艺条件优化

取200 g高粱粉,加入1 800 mL沸水,95 ℃水浴并不断搅拌,按400 U/g高粱粉干质量加入α-淀粉酶,搅拌液化1 h。取出后晾冷至40 ℃左右,按500 U/g高粱粉干质量加入糖化酶,放于65 ℃恒温糖化2 h。糖化完成后用4层纱布过滤,得到滤液,高压蒸汽灭菌15 min,冷却至常温,制得高粱糖化液。

MRS培养基:无水葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、无水乙酸钠5 g、柠檬酸铵2 g、K2HPO4·3H2O 2 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·H2O 0.25 g、吐温80 1 mL,蒸馏水1 L,pH值6.2±0.1,121 ℃灭菌20 min。

从嗜酸乳杆菌干粉中获得的乳酸菌菌株在MRS培养基中培养至对数期(OD600为1.3左右),接种于100 mL高粱糖化液。采用单因素优化法,分别考察发酵时间(1、2、3、4、6、8、10 d),发酵温度(25、30、34、37、40 ℃),接种量(5%、10%、15%、20%)对高粱厌氧发酵产乳酸的影响,厌氧瓶有效容积100 mL,每组3次平行,定期取样检测发酵液中乳酸质量浓度,并计算乳酸转化率。

乳酸转化率的计算方法见式(2)。

(2)

式(2)中,乳酸产量为发酵结束后乳酸发酵液中乳酸的质量分数,总糖消耗量为发酵前后乳酸发酵液中总糖质量分数的差值。

1.3.4第一步乙醇发酵液的发酵工艺条件优化

取250 g高粱粉加水定容至1 L,添加酿酒活性干酵母2 g,按100 U/g高粱粉干质量加入α-淀粉酶干粉,通过称重法每12 h测定发酵质量损失,并考察发酵温度(20、25、30、34、37 ℃)、料水比[m(高粱粉)∶V(水)=1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 g/mL]对高粱发酵产乙醇的影响,厌氧瓶有效容积为1 L,每组3次平行,发酵结束时取样100 mL,测定发酵液酒精度,计算乙醇转化率。

乙醇转化率的计算方法见式(3)。

(3)

式(3)中,乙醇产量为发酵结束后乙醇发酵液中乙醇的质量分数,总消耗淀粉理论乙醇产量为发酵前后乙醇发酵液中淀粉质量差值理论生成乙醇的质量分数。

1.3.5第二步己酸发酵底物组合的优化

3种发酵液在12 000 r/min条件下离心8 min,分别收集上清液,加去离子水稀释调整后,得到丁酸、乙酸质量浓度分别为20 g/L和8 g/L的丁酸发酵液,乳酸质量浓度为10 g/L的乳酸发酵液,乙醇质量浓度为20 g/L的乙醇发酵液。

不同发酵底物组合的己酸发酵实验设计见表1。采用批次发酵方式,于100 mL厌氧发酵瓶中,控制产己酸发酵体系中总物质的质量浓度为10 g/L,以上述3种发酵液为发酵底物组合发酵;设置1种发酵液发酵组(M1、M2、M3),2种发酵液组合发酵组(M4、M5、M6)和3种发酵液组合发酵组(M7),M7中乙醇和乳酸质量浓度比值为1∶1;均接种体积分数为10%的己酸复合菌液,调节pH值为5.6±0.1,每组3次平行,35 ℃条件下厌氧发酵,每3 d取样测定己酸质量浓度,并计算最终己酸产率。

表1 不同底物组合的己酸发酵实验设计

己酸产率的计算见式(4)。

(4)

式(4)中,高粱消耗量为己酸发酵液中初始底物换算为高粱消耗的量,见表1。

1.3.6第二步乙醇发酵液与乳酸发酵液添加比的优化

乙醇发酵液与乳酸发酵液添加比的优化实验设计见表2。以最优底物组合,添加丁酸发酵液12.5 mL,控制己酸发酵体系物质总质量浓度为13.5 g/L,通过添加不同比例的乙醇发酵液与乳酸发酵液,得到不同的乙醇与乳酸添加质量浓度比例(1∶1、2∶1、3∶1、1∶2、1∶3),并对己酸的合成性能进行研究。控制发酵条件,每7 d取样测定丁酸、乙酸、乙醇、乳酸、己酸的质量浓度。

表2 不同乙醇发酵液与乳酸发酵液添加比的己酸发酵实验设计

1.3.7发酵液中目标产物质量浓度的测定

1)发酵液预处理。取1 mL发酵液于15 mL离心管中,加入1 mL5 g/L 2-乙基丁酸,再加入100 μL甲酸,用乙醇定容至5 mL,以12 000 r/min 离心5 min,取上清液于样品瓶中,用于气相检测发酵液中丁酸、乙酸、己酸的质量浓度。

取1 mL发酵液于2 mL离心管中,以12 000 r/min离心5 min,过0.22 μm微孔滤膜,取100 μL上清液加900 μL超纯水(稀释10倍),转移至进样品瓶中,用于液相检测发酵液中乙醇、乳酸的质量浓度。

2)气相色谱条件。毛细管色谱柱为LZP-930(30 m×0.32 mm×1.0 μm),不分流,进样量1 μL,进样口温度为230 ℃;程序升温:50 ℃保持6 min,从5 ℃/min升温至170 ℃,保持5 min;载气为高纯度氮气,载气压力0.05 MPa。

3)液相色谱条件。色谱柱为Hi-Plex H (300 mm×7.7 mm×8 μm),流动相为5 mmol/L H2SO4水溶液,流速为0.6 mL/min,上样量为20 μL,柱温为55 ℃。

1.3.8发酵液其他理化指标的测定

淀粉含量测定参照GB 5009.9—2016《食品安全国家标准 食品中淀粉的测定》中酸水解法;总糖含量测定参照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》中直接滴定法;酒精度测定参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准 酒中乙醇浓度的测定》中蒸馏法。

1.3.9己酸发酵过程中微生物群落分析

通过无菌操作收集1.3.6节中最优己酸发酵组的0、8、14 d的己酸发酵液样品,置于-80 ℃冰箱保存待用,对样品细菌16S rRNA的V3～V6区设计引物(338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT′3′),通过上海美吉生物医药科技有限公司高通量测序平台(Illumina MiSeq PE300)进行高通量测序,所得数据经过质控、过滤和拼接并对相似度大于等于97%的操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)进行聚类,比对Silva数据库(SSU123)进行分物种注释。

1.4 数据处理

采用Excel 2019对数据进行处理,使用SPSS 23.0对数据结果进行统计分析,采用Origin 2021绘图。

2 结果与分析

2.1 丁酸发酵液的发酵工艺条件优化结果

为探究丁酸发酵液的最佳发酵条件,本研究通过单因素实验考察了发酵时间、发酵温度和菌液接种量对丁酸发酵液发酵情况的影响,见图2。由图2(a)可知,从发酵时间上看,在1～9 d内,随着发酵时间的延长,丁酸和乙酸质量浓度呈现逐渐增加的变化趋势,在第7天后丁酸和乙酸质量浓度变化不显著(P>0.05),这可能是发酵至第7 d酸类物质的积累导致发酵液pH降低抑制微生物的生长代谢。因此选择发酵时间7 d为宜。

不同字母表示差异显著(P<0.05)。

厌氧发酵产酸过程中,温度通过影响微生物生命活动及相应酶的活性,从而影响最终代谢产物的产量[16],由图2(b)可知,随着温度的升高丁酸、乙酸质量浓度和淀粉转化率呈现先增加后降低的变化趋势,在37 ℃达到最高值,丁酸、乙酸产量分别为20.16 g/L和8.47 g/L,淀粉转化率达76.02%,并且显著高于其他组(P<0.05)。因此选择发酵温度37 ℃为宜。

接种量直接影响着发酵过程中的微生物的生长速率,从而影响发酵周期[17],由图2(c)可知,随着菌液接种量增加,丁酸产量和淀粉转化率呈现先升高后降低的变化趋势,在菌液接种量为10%时丁酸和乙酸质量浓度达到最高值,但当接种量大于10%后,丁酸质量浓度差异不显著(P>0.05)但淀粉转化率却急剧下降。因此选择最佳菌液接种量为10%。

在己酸两步法厌氧发酵中,提高第一步中高粱的转化率是后续产己酸高转化率的前提,最终确定在发酵温度为37 ℃条件下,接种10%的己酸复合菌液,发酵7天为高粱厌氧发酵产丁酸和乙酸的最佳条件,此时丁酸发酵液淀粉转化率达到76.02%,丁酸、乙酸产量分别为20.16 g/L和8.47 g/L。

2.2 乳酸发酵液的发酵工艺条件优化结果

乳酸的发酵过程中乳酸菌可通过生成乳酸形成酸性环境和分泌细菌素等方式抑制杂菌的生长,从而实现乳酸的定向转化[18],为得到乳酸发酵液的最佳发酵条件,本研究通过单因素实验考察了发酵时间、发酵温度和乳酸菌接种量对高粱厌氧发酵产乳酸的影响,见图3。

不同字母表示组间差异显著(P<0.05)。

发酵时间对高粱厌氧发酵产乳酸的影响结果见图3(a),由图3(a)可知,乳酸质量浓度随发酵时间增加呈现逐渐增加的变化趋势,在前2 d乳酸质量浓度增长较快,在第4 天时进入稳定期,在8 d后乳酸质量浓度不再呈现显著变化(P>0.05),因此选择发酵时间8 d为宜。

发酵温度对高粱厌氧发酵产乳酸的影响结果见图3(b),由图3(b)可知,随着发酵温度升高乳酸质量浓度和乳酸转化率均呈现先增加后降低的变化趋势,在发酵温度34 ℃时乳酸质量浓度和转化率均达到最高,为11.41 g/L和42.48%,与其他发酵温度呈现显著差异(P<0.05)。赵微等[19]从清香型白酒酒醅中筛选的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)SL32-2,在高粱糖化液中产乳酸的最佳发酵温度为35 ℃,与本研究最适温度接近。因此选择发酵温度34 ℃为宜。

乳酸菌接种量对高粱厌氧发酵产乳酸的影响结果见图3(c),由图3(c)可知,随着乳酸菌接种量的增加乳酸产量和转化率整体呈现先降低再增加的变化趋势,在较少的接种量(体积分数为5%)时,乳酸产量和转化率均达到最高值。因此选择最佳接种量为5%。

因此选择发酵温度34 ℃,乳酸菌接种量为5%,发酵8 d,为乳酸发酵液最优发酵条件,此时乳酸产量和转化率达到11.41 g/L和42.48%。

2.3 乙醇发酵液的发酵工艺条件优化结果

为得到乙醇发酵液最佳发酵条件,本研究通过单因素实验考察了发酵时间、发酵温度和接种量对高粱厌氧发酵产乙醇的影响,见图4。酵母的乙醇发酵常伴随着CO2的生成,因此以酿酒酵母发酵的累计失重来表征其发酵情况,由图4(a)可知,在发酵前72 h,发酵累计失重变化较快,酿酒酵母生长代谢较旺盛,在72 h到144 h发酵累计失重变化曲线逐渐变平缓,在168 h后累计失重量变化不再明显,表明此时发酵结束,因此选择发酵时间168 h为宜。

不同字母表示组间差异显著(P<0.05)。

发酵温度对高粱厌氧发酵产乙醇的影响结果见图4(b),由图4(b)可知,发酵液酒精度和乙醇转化率随着发酵温度的增加均呈现先增加后减小的变化趋势,在温度为25 ℃时发酵液酒精度和乙醇转化率均达到最高,显著高于其他发酵温度(P<0.05)。温度过低会使发酵速度缓慢,延长产酒周期;温度过高会抑制酵母菌生长代谢。因此选择25 ℃作为高粱乙醇发酵的合适温度。

相同发酵质量,料水比反映了发酵液中淀粉的含量,淀粉含量过高容易造成原料的浪费,淀粉含量过低又不能满足酿酒酵母发酵所需碳源,以至于出酒酒度不高[20]。不同料水比对高粱厌氧发酵产乙醇的影响结果见图4(c)。由图4(c)可知,随着料水比的降低,发酵液酒精度呈现逐渐降低变化趋势,但乙醇转化率呈现先增加后降低的变化趋势,在料水比为1∶3时达到最高,显著高于其他料水比(P<0.05)。虽然料水比在1∶2条件下的发酵液酒精度较高,但乙醇转化率相较于料水比1∶3更低,说明在料水比为1∶2时酿酒酵母对淀粉质原料的利用率不高,为节约原料成本,选用1∶3作为最佳的高粱乙醇发酵的料水比。

因此,选择发酵温度25 ℃,料水比为1∶3时,发酵7 d为乙醇发酵液最佳发酵条件,发酵液酒精度高,乙醇转化率可达95.06%。

2.4 己酸发酵底物组合的优化结果

碳链的延长往往需要电子供体等还原性物质提供ATP和还原力(NADH)[4],己酸发酵过程中电子供体的多样性,反映了电子供体转移电子的难易程度,从而影响己酸的产量[21]。因此本研究探究了以不同电子供体为底物己酸发酵情况的差异,结果见图5。由图5可知, M1、M2、M3、M6的产己酸效果明显弱于其他组,说明当发酵底物缺乏电子供体(M3)或者电子受体(M1、M2、M6)时,不利于己酸发酵。

图5 发酵底物对己酸发酵的影响Fig.5 Effect of fermentation substrate on caproic acid fermentation

当以乙醇(M4)或乳酸(M5)发酵液提供电子供体时,产己酸效果显著,其中M4组在前6 d己酸增长较快,在第9天进入稳定期,在12 d后己酸质量浓度变化不大,最终己酸质量浓度达到2.20 g/L。此时乙醇为电子供体,乙醇首先被乙醇脱氢酶氧化生成乙醛,并在乙醛脱氢酶作用下产生乙酰辅酶A,产生能量,然后进入循环[22]。第二步是乙酸和丁酸的还原,2个乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A,经脱氢、脱水、还原生成丁酰辅酶A。同时,在乙酰辅酶A转移酶的作用下,乙酸与丁酰辅酶A反应生成新的乙酰辅酶A和丁酸。丁酰辅酶A和乙酰辅酶A被转化为己酰辅酶A,己酰辅酶A在酰基辅酶A转移酶的作用下,与丁酸反应生成己酸[8,10]。M5在发酵前6 d己酸产量较低,之后己酸增长迅速,在12 d 时进入稳定期,15 d后趋于稳定,己酸产量达2.89 g/L。此时乳酸为电子供体,但己酸发酵启动较M4组缓慢,可能原因是从代谢途径来看,乳酸首先被乳酸脱氢酶氧化生成丙酮酸,丙酮酸再经过丙酮酸脱羧酶生成乙酰,结合辅酶A生成乙酰辅酶A,需经过两步氧化,然后再参加逆β氧化实现碳链延伸[15]。从微生物角度来看,对于混菌发酵体系下,发酵前期产己酸微生物需要适应环境,在多菌合作协同之下实现不断富集。史阳[23]也发现以乳酸为电子供体进行己酸发酵时,前期乳酸消耗仿佛仅为己酸的生成提供相应的短链碳骨架,需要后续补充乳酸来驱动己酸的合成。

当以乙醇和乳酸发酵液同时提供电子供体时,观察M7发现,发酵前6 d己酸质量浓度增长速度较快,随着发酵的进行,己酸质量浓度逐渐增加,第12天进入稳定期,第15天己酸质量浓度浓度达到4.15 g/L,表明乙醇和乳酸同时作为电子供体时,己酸发酵周期缩短,己酸产量显著提高。这可能是乙醇和乳酸在己酸发酵过程中产生过剩的H2和CO2可以经过同乙酰化和将乙酸还原再生成乙酸和乙醇,随后进一步参加碳链的延长,因此促进了己酸的生成[22,24]。

本研究以高粱为原料经两步发酵的方式生产己酸,因此己酸的原料转化率值得被关注,计算不同发酵底物组的己酸产率见表3。由表3可知,当以乙醇发酵液提供电子供体时(M4),己酸产量虽然仅有2.2 g/L,但己酸的高粱转化率达到67.05 mg/g,相比于乳酸发酵液提供电子供体(M5),己酸产量虽然有2.89 g/L,但己酸产率只有37.29 mg/g。当乙醇和乳酸发酵液同时提供电子供体时,己酸产量和产率都得到了显著提升,分别达到4.15 g/L和75.20 mg/g。因此也同样证明了乙醇和乳酸同时作为电子供体能有效提高己酸的原料转化率。

表3 发酵底物组合对己酸产量和产率的影响

2.5 乙醇发酵液与乳酸发酵液添加比的优化结果

Zhu等[25]以窖泥为接种物合成中链脂肪酸时,发现窖泥菌群更偏好于消耗乳酸合成中链脂肪酸,而乙醇几乎不消耗。2.4节发现同时以乙醇和乳酸为电子供体时己酸发酵效果较好,本研究所用接种物为己酸复合菌液,在此混菌发酵体系中,产己酸微生物对乙醇和乳酸的利用或许也存在偏好,乙醇和乳酸的添加比例可能也会引起己酸发酵体系中微生物的改变,从而影响最终的己酸形成。

乙醇发酵液与乳酸发酵液添加比对己酸发酵的影响结果见图6。由图6可知,不同比例的乙醇发酵液与乳酸发酵液添加比对己酸的生成有着一定的影响,在发酵14 d后己酸产量分别为5.19 g/L (添加比为1∶3)、5.15 g/L (添加比为1∶2)、5.34 g/L (添加比为1∶1)、6.65 g/L (添加比为2∶1)、4.82 g/L(添加比为3∶1)。随着乙醇比例的增加,发酵结束时己酸质量浓度整体呈现先增加后降低的变化趋势,丁酸的质量浓度呈现逐渐增加的变化趋势,发酵过程中乙酸的变化,呈现了先增加后降低的变化趋势,这可能与发酵前期产酸微生物占优势有一定的关系,随着发酵进行,优势微生物菌群发生变化,或者同种微生物代谢途径也会有所改变,从而乙酸质量浓度降低[23]。

图6 乙醇发酵液与乳酸发酵液添加比对己酸产量的影响Fig.6 Effect of addition ratio of ethanol fermentation broth to lactic acid fermentation broth on caproic acid yield

乙醇比例较低的组别(添加比为1∶3和1∶2),主要以乳酸消耗为主,乙醇消耗较少,并且仍然有剩余乳酸未被利用,可能乳酸为电子供体形成乙酰辅酶A时会释放CO2,有一定的碳流失,导致部分微生物的生长代谢受到一定的限制,因而微生物对乙醇的利用也不够充分[26]。当乙醇发酵液与乳酸发酵液比例提升至2∶1时,发酵结束时乳酸几乎消耗完全,此时己酸质量浓度也达到最高,但当乙醇发酵液与乳酸发酵液添加比值达到3∶1时,己酸质量浓度反而降低。说明过高或偏低的乙醇和乳酸添加比都不利于己酸的形成。

不同乙醇发酵液与乳酸发酵液添加比对己酸产量和产率的影响见表4。由表4可知,随着乙醇比例的增加,己酸产率呈现先增加后减小的变化趋势,在乙醇发酵液与乳酸发酵液添加比为2∶1时,己酸产率达到最高,达99.78 mg/g,此时发酵液中底物的转化效率更高,对原料高粱的利用更充分。因此适当提高乙醇发酵液与乳酸发酵液添加比,能有效地促进己酸的生成,当乙醇发酵液与乳酸发酵液添加比为2∶1时,为己酸发酵的优化条件。

表4 不同乙醇发酵液与乳酸发酵液添加比对己酸产量和产率的影响

2.6 己酸发酵过程中微生物群落结构多样性分析

不同己酸发酵时期门和属水平上的细菌群落组成情况见图7,从3个发酵液样本中检测到5个门,82个属的细菌。由图7(a)可知,其中有5个细菌门,包括厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacter-iota)、拟杆菌门(Bacteroidetas)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi) ,其中占优势的菌群是厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteriota)、拟杆菌门(Bacteroidetas)。随着发酵进行,厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)在发酵液中的相对含量呈现先减小再增加的变化趋势,然而拟杆菌门(Bacteroidetas)呈现先增加后减小的变化趋势。由图7(b)可知,己酸菌属(Caproiciproducens)、乳杆菌属(Lactobacillus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)、普氏菌属(Prevotella)是发酵过程中的4个优势菌群。

图7 己酸发酵过程中细菌门水平和属水平群落组成Fig.7 Community composition of bacteria at phylum level and genus level during caproic acid fermentation

在发酵0 d时Caproiciproducens丰度仅8.58%,

随着发酵进行己酸菌属不断富集,到发酵后期相对丰度达到37.81%。有研究表明Caproiciproducens能代谢半乳糖醇产生氢气、乙醇、乙酸、丁酸和己酸[27],是浓香型白酒中的特征香味物质己酸乙酯的主要合成菌[28]。Lactobacillus能利用碳源代谢产乳酸,为己酸的生成补充相应的电子供体。在发酵0 d时Lactobacillus丰度占比19.88%,在发酵8 d时丰度达到最高28.58%,但在发酵后期丰度仅有0.45%。可能因为发酵后期,底物中的碳源消耗完全,乳酸菌开始衰亡[29],Caproiciproducens也因此逐渐占据优势。Prevotella在发酵过程中丰度呈现先增加后减小的变化趋势,在第8 天时丰度达到最高26.94%,14天时丰度下降至6.59%,有研究表明普氏菌属能降解淀粉、蛋白质等大分子有机物质,代谢产生乙酸和丙酸等有机物[30],推测这些代谢物质给其他微生物也提供了相应的碳源和氮源。

Clostridium_sensu_stricto_1、Clostridium_sensu_stricto_12在发酵后期的丰度分别占11.27%、13.65%。这类梭菌属微生物拥有较广泛可利用的底物,促进了厌氧发酵体系中的碳、氮和硫元素的循环,Clostridium_sensu_stricto_1在白酒窖泥中也是重要的微生物,不仅为己酸乙酯的形成提供了前体物质,而且对厌氧发酵体系的微生物结构起到了稳定的作用。有些梭菌利用乳酸代谢生成转化丁酸,丁酸进一步作为电子受体促进己酸的形成[31]。也有研究发现通过乙醇对瘤胃微生物富集后Clostridium_sensu_stricto_12成了优势菌属,并与己酸产量呈正相关关系[32]。推测该梭菌类微生物能利用乙醇和乳酸,通过代谢为Caproiciproducens提供了更多的营养物质,这也间接证明之前乙醇和乳酸组合发酵时己酸生成效果更佳的结论。

2.7 己酸发酵过程中微生物与代谢物质相关性分析

在己酸发酵过程中,代谢物质含量与微生物相关性分析结果见图8。由图8可知,Caproiciproducens、Clostridium_sensu_stricto_12、Pseudoclavibacter的相对丰度和己酸、丁酸含量呈显著正相关(P<0.05),与乙醇和乳酸含量呈现显著负相关(P<0.05);Pseudoclavibacter是放线菌门微生物,郭威等[33]将放线菌和己酸菌共培养,发现放线菌不产生己酸,但可以耐受一定量的乙醇,并促进己酸菌利用乙酸和乙醇产己酸,结合之前最优己酸发酵条件,推测在乙醇发酵液与乳酸发酵液添加比较高时(2∶1),可能更有利于该类微生物富集。Clostridium_sensu_stricto_1、Atopobium、Weissella相对丰度与乙酸含量呈显著负相关(P<0.05);Prevotella、norank_f_Eggerthellaceae相对丰度与乙酸含量呈显著正相关,Fraga等[34]研究也表明在瘤胃中乙酸和丁酸比例的提高和普雷沃氏菌(Prevotellabryantii3C5) 具有较强的关联性。

***表示两指标之间差异显著(P<0.05)。

研究表明己酸发酵过程中,Caproiciproducens、Clostridium_sensu_stricto_12、Pseudoclavibacter可能利用乙醇和乳酸等有机物,代谢生成了己酸或生成了促进己酸合成的前体物质。其余大多微生物主要与短链脂肪酸(乙酸、丁酸)有较强的关联。

3 结 论

研究结果表明,合理控制发酵时间、接种量、发酵温度等条件,可提高第一步发酵中相应发酵液的转化率,最终丁酸发酵液中的丁酸、乙酸产量达到20.16 g/L和8.47 g/L,淀粉转化率达到76.02%;乳酸发酵液中的乳酸产量和乳酸产率分别达到11.41 g/L 和42.48%;乙醇发酵液中的乙醇产率可达95.06%。继续优化己酸发酵工艺,发现当乙醇发酵液和乳酸发酵液同时作为电子供体时,己酸产量和产率均显著提升,分别达到4.15 g/L和75.20 mg/g, 且当乙醇发酵液和乳酸发酵液中乙醇与乳酸添加的质量浓度比为2∶1时,己酸产量和产率均达到最高,分别为6.65 g/L和99.78 mg/g。对己酸发酵过程中微生物与己酸的相关性分析发现,发酵过程中和己酸含量呈正相关的微生物有Caproiciproducens、Clostridium_sensu_stricto_12、Pseudoclavibacter。其中Caproiciproducens随着发酵进行不断富集,到发酵后期相对丰度达到37.81%,是己酸形成的主要贡献者。希望研究可为在无外源电子供体添加条件下,实现高粱两步法厌氧发酵生产己酸提供理论基础,为拓展高粱的资源化利用提供新思路。