化橘红提取物在早期糖尿病肾病大鼠中多靶点防治作用的研究

杨帆，王岑婷，王海霞，张晨

1广州医科大学附属市八医院肝胆外科，广州 510440；2广东药科大学临床药学学院、临床药学学院（综合药学学院）学系，广州 528405；3毕节市第三人民医院药剂科，毕节 551799；4广州市第一人民医院临床药学科，广州 510180

糖尿病是一种慢性代谢性疾病，已成为全球主要的公共卫生问题之一。据统计，全球约4.63 亿糖尿病患者，其中约40%会发展成糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）[1]。DN 是糖尿病最常见、最严重的并发症之一，其发生、发展与高血糖、高血压等因素密切相关。DN 病情逐渐恶化，最终可能导致肾功能衰竭，严重影响患者的生活质量甚至生命安全[2]。目前，DN 的治疗选项有限，主要依靠控制血糖和血压水平来延缓肾功能的恶化。然而，目前可用的降糖药物和降压药物效果有限，且长期使用可能引发一系列副作用。因此，寻找更有效的治疗方法和新的药物靶点对于预防和治疗DN 具有重要意义[3]。

化橘红提取物是一种从植物中提取的天然药物，具有多种生物活性成分，如类黄酮、萜类化合物等[4-5]。近年来，研究表明化橘红提取物可能具有对DN 多靶点的防治作用，其中最引人注目的是化橘红提取物对钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT2）的作用。SGLT2 是一种在肾小管中广泛表达的膜蛋白，负责重吸收尿液中的葡萄糖。糖尿病患者的肾小管对葡萄糖的重吸收能力增强，导致尿液中的葡萄糖排出不畅，加重了高血糖的病理过程[6]。因此，SGLT2 成为预防和治疗糖尿病性肾病的新靶点[7]。研究表明，化橘红提取物可能通过抑制SGLT2 活性，减少肾小管对葡萄糖的重吸收，从而降低尿液中葡萄糖的排泄，改善高血糖状态。同时，化橘红提取物还可能通过调节炎症因子、抗氧化剂以及减轻肾小球硬化等多个途径，发挥对DN 的治疗作用。

尽管目前对于化橘红提取物在DN 中的作用机制尚不完全清楚，但已有的研究成果显示了其潜在的治疗效果。因此，本研究旨在进一步探究化橘红提取物在DN 中的多靶点防治作用，并为其作为预防和治疗糖尿病性肾病的新靶点提供更多科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF 级Wistar 大鼠90 只，雄性和雌性各半，体重（280±20）g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK（辽）2020-0001。饲养于温度20～22℃、相对湿度60%～70%环境，自由进食和饮水。标准型饲料（玉米粉40%、面粉26%、豆饼10%、鱼粉10%、小麦麩皮10%、矿物质占2%，1%粗盐和综合维生素）、高糖高脂饲料（61.5%基础饲料，蔗糖20%，猪油10%，蛋黄粉5%，胆固醇2.5%，胆酸盐1%）购于南通特洛菲饲料科技有限公司，饲料代码：LAD0011。本研究经广州市第八人民医院伦理委员会批准）。

1.1.2 实验药品与配置 化橘红药材由广东省橘乡农业开发有限公司提供，由广东医科大学天然药物研究与开发重点实验室巫鑫博士鉴定为化橘红，其中柚皮苷12.8%，柚皮素0.13%，10 μg/ml 5 年仓储化橘红为萃取产物最大浓度。动物实验干预采用化橘红水煎液，50 g化橘红加水煎至200 ml[8]。盐酸贝那普利片（国药准字：H20000292，北京诺华制药有限公司），规格为每片10 mg，药片捣碎后用蒸馏水溶解，配成浓度为0.09 g/L 的悬浊液，每100 g 大鼠需要灌胃1 ml溶液。

1.1.3 主要试剂与仪器 造模药物为链脲佐菌素（STZ，品牌：Sigma 货号：S0130，进口），在使用前稀释至浓度为20 mg/ml 的STZ 液，使用0.1 mol/L 的无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液（国药准字：H43020205，湖南尔康制药股份有限公司）进行配制。麻醉药物：10%水合氯醛（国药准字：H37022673，青岛宇龙海藻有限公司）。细胞计数试剂盒8（cellcounter kit-8，CCK-8）购自Dojindo Lab（日本）。DMEM 培养基购于Hyclone 公司（USA），温度控制器、湿度控制器、通风设备由大连华正仪器设备有限公司生产并提供，型号：HC-1000 温湿度控制器、FV-2000 通风设备。饲料自动投喂器、饮水设备又上海迈特宠物用品有限公司生产并提供，型号：AF-1000 饲料自动投喂器、DW-2000 饮水设备。煎药设备、搅拌器由上海金博医疗器械有限公司生产并提供，型号：JB-1000 煎药设备、MB-2000 搅拌器。溶液制备设备由北京科华生物技术有限公司生产并提供，型号：KP-1000。

1.2 实验方法

1.2.1 造模与分组 大鼠适应饲养1 周，随机选10 只作为正常对照组，给予常规饮食。其余80 只通过高脂高糖饲料喂养结合STZ 注射建立早期DN 大鼠模型：高糖高脂饲料喂养1 周后，大鼠禁食12 h，腹腔一次性注射STZ 42 mg/kg，诱导糖尿病模型。注射STZ 前，先用0.1 mol/L 无菌柠檬酸缓冲液（pH 4.2）配制，正常对照组用等量无菌柠檬酸缓冲液进行腹腔注射。注射STZ 后72 h 尾静脉取样，空腹血糖（FBG）浓度≥16.7 mmol/L，即糖尿病造模成功注射STZ 2 周后，收集实验大鼠24 h 的尿液，24 h 微量白蛋白（U-mA1b）30～300 mg，则早期DN 大鼠模型制备成功，其中3 只大鼠不符合早期DN 模型标准而被剔除。将造模成功大鼠随机分为模型空白组、西药组、中药预防组、中药低剂量组、中药高剂量组。

1.2.2 给药方法 大鼠给药量按照人体（g/kg）与大鼠体表面积比值（1 ∶6.3）的等效剂量换算，中药预防组和中药低剂量组大鼠的每日给药量为12.8 g/kg，中药高剂量组给药剂量为低剂量组的3 倍；西药组大鼠的每日给药剂量为0.9 mg/kg。中药预防组大鼠在糖尿病造模成功后，立即应用化橘红提取物灌胃干预，1 次/d，共计给药10 周；西药组、中药低剂量组和高剂量组大鼠均在2 周后，即DN 模型制备成功后，进行灌胃给药，1 次/d，共计给药8 周。正常对照组和模型空白组大鼠给予等量生理盐水灌胃，1 次/d。实验期间，大鼠自由饮水，不使用任何降糖药物及注射胰岛素。

1.2.3 样本采集 采尿：实验过程中禁食、不禁水，分别放置在代谢笼中24 h，采集尿液。共采集大鼠2 次24 h 尿测，给药后2 周（判定DN 大鼠模型成功与否）和大鼠取药前（以化橘红为干预指标）。采血：复制大鼠后，每星期称重一次，并取尾静脉血。试验完成之前，分别采集各组大鼠24 h 的尿，禁食12 h。第2 天，采用10%水合氯醛（剂量4 ml/kg）的腹腔注射麻醉。肾组织留取：取大鼠全血后，取左右肾，用生理盐水冲洗，滤纸吸取血，去除被膜，用4%多聚甲醛溶液固定左肾。将右肾纵切成两半，取2 个50～100 mg肾组织，分别放入装有trizol 的高压灭菌EP 管内；将两个100～200 mg 的肾组织分别从另半肾的皮髓交界部位取出，放入高压灭菌EP 管内。将剩余肾脏组织置入高压灭菌EP 管内备用。肾组织病理染色：将已固定的肾组织冲洗，脱水，二甲苯浸泡透明，石蜡包埋，切片（5 μm），行苏木精-伊红（HE）染色和过碘酸希夫（PAS）染色。

1.2.4 指标检测 空腹血糖（FBG）和糖化血红蛋白（HbA1C）：大鼠取材前的FBG 检测是应用血糖仪进行检测；而取材后的FBG 检测方法是葡萄糖氧化酶法；检测糖化血红蛋白HbA1C 的方法是高压液相层析法。尿微量白蛋白（U-mA1b）：采用免疫透射比浊法检测各组大鼠的24 h U-mA1b 含量[9]。血β2微球蛋白（β2-MG）：采用乳胶增强免疫比浊法检测各组大鼠血清中β2-MG 的含量。尿素氮（BUN）和肌酐（SCr）：检测各组大鼠血清中尿BUN 和肌酐SCr 水平的方法分别是脲酶-谷氨酸脱氢酶连续监测法及肌酐酸氧化酶法。

SGLT2：逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测SGLT2 基因在大鼠中的转录水平，需要从大鼠组织或细胞中提取总RNA，使用逆转录酶将RNA 转录成cDNA。使用特定的引物（引物是与待检测基因的序列互补的短链DNA）进行PCR 扩增，得到目标基因的片段。通过电泳等方法分析PCR 产物，检测SGLT2 基因的mRNA 表达水平。同时，免疫组化法检测蛋白表达水平，将组织切片后，利用特异性抗体对SGLT2 蛋白进行染色和检测。

AGES：使用RNA 提取试剂盒，从组织样本或细胞中提取总RNA。通过乙醇沉淀或使用RNA 纯化柱等方法对提取的RNA 进行纯化，以去除污染物和DNA。利用逆转录酶将提取的RNA 反转录合成cDNA，作为后续PCR 扩增的模板。使用特异性引物和荧光探针对AGES mRNA 进行定量PCR 检测，得到相对表达水平。从组织样本或细胞中提取蛋白质，使用RIPA 缓冲液等标准方法。将蛋白质样本加入聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中，分离蛋白质。将SDS-PAGE 凝胶中的蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜（PVDF 膜）或硝酸纤维素膜上。使用特异性抗体结合AGES 蛋白，并通过化学发光或荧光等方法检测蛋白质的表达水平。

RAGES：从大鼠肾脏组织中提取RNA，使用RNA 提取试剂盒，按照说明书提取总RNA。利用逆转录酶将RNA 转录成cDNA，使用RT-PCR 试剂盒进行cDNA 合成。使用荧光定量PCR 技术，利用特异性引物和探针来检测RAGES 基因的mRNA 水平，同时进行内参基因（如GAPDH、β-actin 等）的定量检测，以进行相对表达水平的计算。同时，检测蛋白表达水平，从大鼠肾脏组织中提取蛋白质。使用蛋白提取缓冲液溶解组织样本，离心去除细胞碎片，获得上清液中的总蛋白。使用蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。将蛋白样本加入聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）槽中，根据分子量进行电泳分离。将分离的蛋白转移到膜上用特异性的抗体结合目标蛋白，用化学发光检测蛋白表达水平。

TGF-β1：①mRNA 表达水平检测：收集大鼠细胞培养物或组织样本，并使用Trizol 或其他适当的试剂来提取总RNA。使用逆转录酶将提取的RNA 转录为cDNA。利用实时荧光定量PCR 技术检测TGF-β1 mRNA 的相对水平。设计特异性引物和探针进行定量PCR 分析，并使用标准曲线法或基因相对表达法来计算TGF-β1 mRNA 的表达量。②蛋白表达水平检测：收集大鼠细胞培养物或组织样本，并使用RIPA 缓冲液或其他适当的方法来裂解细胞膜并提取总蛋白。使用BCA 蛋白定量试剂盒确定蛋白含量。将提取的蛋白样本进行SDS-PAGE 凝胶电泳分离后转移到膜上。使用特异性抗体检测TGF-β1 蛋白的表达水平，并利用化学发光法定量分析蛋白表达水平。

1.3 统计学方法 实验数据使用SPSS 25.0 软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状态 正常对照组大鼠表现正常，进食和饮水正常，精神饱满，毛发有光泽，运动能力良好，体重明显增加。模型空白组大鼠呈现“三多”症状：多饮、多食、多尿，精神萎靡，毛发干枯，拱背蜷卧，活动减少，反应迟钝，体重减轻，实验期间有2 只大鼠死亡。干预组大鼠表现出类似症状，但经药物干预后症状有所缓解。中药预防组大鼠状态最佳，饮水量略增，进食量无明显差异，日更换1 次垫料，实验期间无大鼠死亡。西药组、中药低剂量组和中药高剂量组大鼠整体状态较强，尿量减少，食水量略增，尿量增加。干预组日更换1 次垫料，实验期间中药低剂量组有1 只大鼠死亡。

2.2 肾组织病理变化 正常对照组显示肾小球硬化、系膜细胞和间质增生，以及肾小管上皮细胞的类空泡变。而模型空白组则出现了肾基底膜厚度增加、系膜区明显增生、栓塞现象普遍、结节形成和空洞。药物治疗后，肾组织的病理性变化减少，PAS 反应通常为弱阳性。在西医处理组中观察到肾小球硬化散发和系膜及间质组织的外基质增加，肾小管萎缩情况。而大剂量药物处理的动物肾小球的系膜区域和系膜细胞出现显著增生，但肾基底膜和肾小管未见明显损害。这些发现证实了模型动物肾脏出现的肾小球系膜增厚、系膜增生等硬化病变特点。见图1。

图1 大鼠肾脏出现肾小球系膜增厚、系膜增生

2.3 观察指标 模型空白组FBG、HbA1C、U-mA1b、β2-MG、BUN 水平均较正常对照组升高，SGLT2、AGES、RAGES、TGF-β1 的mRNA 和蛋白表达水平均较正常对照组升高，中西药物干预后上述指标均较模型空白组降低（P＜0.05）；其中，中药预防组干预效果最佳。见表1～2。

表1 各组大鼠血糖和肾功能指标比较

表2 各组大鼠SGLT2、AGES、RAGES、TGF-β1的mRNA和蛋白水平比较

3 讨论

DN 是糖尿病患者常见的并发症之一，临床上缺乏有效治疗手段。因此，寻找新的治疗靶点和策略对于DN 的预防和治疗具有重要意义[9-10]。近年来，植物提取物在疾病治疗中的应用引起了广泛关注。化橘红作为一种天然植物提取物，具有广泛的药理活性，并且已被证明在DN 治疗中具有潜在的作用。在本研究中，我们进一步探讨了化橘红在DN 中的多靶点防治作用，并重点研究了化橘红对潜在抑制SGLT2 的作用[11]。SGLT2 是一种位于近曲小管和肾小管上皮细胞的钠-葡萄糖协同转运蛋白，主要负责肾小管中对葡萄糖的再吸收。在糖尿病患者中，高血糖导致肾小管对葡萄糖的再吸收增加，从而导致尿液中葡萄糖的排泄减少，进一步加重DN 的发展。因此，抑制SGLT2 的功能可能成为治疗DN 的新靶点。

本研究结果显示，模型空白组FBG、HbA1C、U-mA1b、β2-MG、BUN 水平均较正常对照组升高，SGLT2、AGES、RAGES、TGF-β1 的mRNA 和蛋白表达水平均较正常对照组升高，中西药物干预后上述指标均较模型空白组降低（P＜0.05），其中中药预防组干预效果最佳。说明在DN 大鼠模型中，给予化橘红提取物治疗后，肾小管中葡萄糖的再吸收明显降低，导致尿液中葡萄糖的排泄增加。此外，化橘红提取物还能够改善DN 大鼠的肾功能，减轻炎症反应和氧化应激。根据国内外学者最新研究发现，化橘红提取物还能够调节多条与SGLT2 相关的信号通路，包括NF-κB 通路、NLRP3 炎症小体通路和ROS 产生通路[12]。这些信号通路的调节可能是化橘红提取物在DN 中的多靶点防治作用的机制之一[13]。

综上所述，化橘红提取物具有潜在抑制SGLT2的作用，并且能够在多个信号通路上调节DN 的发展，这些发现为化橘红提取物作为新的预防和治疗糖尿病性肾病的靶点提供了理论基础。然而，需要进一步的研究来验证其临床应用的安全性和疗效，以及深入探究其作用机制。