红霉素高产菌株选育及其发酵条件的优化

李春玲,牛莎莎, 牛 春,石彦鹏,张 萍

(宁夏泰瑞制药股份有限公司, 银川 750101)

红霉素(Erythromycin)是一种大环内酯类抗生素,其分子式为C37H67NO13,由放线菌属(Actinomycetes)红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)通过次级代谢途径生成[1-3]。红霉素及其半合成衍生物阿奇霉素(Azithronmycin)、甲红霉素(Clarithromycin)、地红霉素(Dirithromycin)、罗红霉素(Roxithromycin)、氟红霉素(Flurithromycin)等,对革兰氏阳性菌具有较好抗性作用,常用于对青霉素耐药的革兰氏细菌感染及对青霉素过敏的患者,是军团菌肺炎、支原体肺炎、沙眼衣原体所致的婴儿肺炎及结肠炎,皮肤软组织感染的首选药,应用较为广泛,生产前景广阔[4-7]。

红霉素主要通过工业发酵进行生产,但目前国内发酵效价一般为4000～5000 mg/mL,与国外水平8000～12000 mg/mL相比,还存在较大差距,究其原因主要在于缺少优良的发酵菌株和适宜发酵条件。因此,优良菌株选育以及配套发酵条件优化是解决这一问题的有效途径。刘峰等[8]通过UV(紫外诱变)诱变,选育出一株发酵效价增加10%的菌株F1-57,并通过添加前体物等措施优化了发酵条件,大幅提高了发酵水平。杨雪清[9]利用红霉素碱作为诱变剂筛选出红霉素耐受性突变株 LJ-12-2,其发酵效价增加10.8%。孟祥学等[10]运用UV(紫外诱变)诱变选育出一株效价增加20%的菌株。赵宏图[11]综合运用离子注入技术、UV诱变、盐酸轻胺诱变开展红霉素发酵生产菌株的选育,并对发酵条件系统优化,使发酵效价达到8500 mg/mL。另外,卞晨光等[12]、刘晓宏等[13]、Zou等[14]开展了发酵条件优化研究,大幅提高了红霉素发酵效价。但是,整体而言当前国内红霉素发酵生产还处于较低水平,亟待提升。鉴于此,本研究以引进保存的产红霉素的红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)SE-2207菌株作为原始菌株,利用EMS(甲基磺酸乙酯)、UV以及ARTP(常压室温等离子体诱变)诱变的方法,对菌株进行诱变处理,选育出优良发酵菌株,并从发酵培养基组成方面优化发酵条件,以期提高发酵水平,推动红霉素规模化发酵生产。

1 材料与方法

1.1 菌种 原始菌株为产红霉素(Erythromycin)的红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)SE-2207菌株,由本实验室低温保藏。

1.2 仪器及耗材 恒温振荡摇床(武汉科学仪器厂,编号:HQL150C)、恒温恒湿培养箱(江苏杰瑞尔电器有限公司,LHP160)、ARTP等离子体生物育种机(北京思清源生物科技有限公司,ARTP-Ⅱ型),紫外分光光度计(德国耶拿,SPECORD S600)、高效液相色谱仪(Watesr公司,E2695)、显微镜(Leica DM500)。Erythromycin对照品购自 Sigma 公司,其他化学试剂为国产分析纯。

1.3 培养基及培养条件 斜面和分离培养基(g/L):淀粉 1,玉米浆 1,氯化钠 0.3,硫酸铵0.3,碳酸钙0.5,琼脂 20, pH 7.0,32 ℃,培养7 d。种瓶培养基(g/L):蔗糖6,硝酸钾 1.0,硫酸铵 0.2,磷酸二氢钾0.3,七水硫酸镁 0.1,pH 7.0。斜面培养基挖块约1 cm3,接种于种子培养基中(250 mL容积的锥形瓶装量40 mL),置于32 ℃摇床,220 rpm,培养32 h。发酵瓶培养基(M/V):黄豆饼粉3%,玉米浆3%,葡萄糖6%,硫酸铵 0.1%,磷酸氢二钾 0.1%,碳酸钙 0.4%,pH自然,接种量8%(500 mL容积的锥形瓶装量80 mL),32 ℃,220 rpm振荡培养,培养7 d。中试(500 L)培养基(g/L):淀粉20,蔗糖53,玉米浆98,酵母粉10,硫酸铵4,磷酸二氢钾 1,氯化钙 2,碳酸钙 0.5,pH自然,温度32 ℃,时间7 d。

1.4 孢子液的制备 参考李春玲等[15]的方法,取成熟斜面孢子,用4.5 mL无菌水冲洗,将冲洗的孢子液用研磨器研磨,然后将菌液用滤纸过滤,离心管收集滤液,稀释至1×10-6浓度备用。

1.5 甲基磺酸乙酯 (EMS)诱变 取一定量的孢子液于无菌三角瓶中,加入EMS(终浓度为0.2%),放在摇床上振荡培养,诱变处理时间分别为1、2、3、4、5 h,然后将孢子液均匀涂布于分离培养基上,以未经EMS处理的孢子液作为对照,于32 ℃培养箱培养 7 d。

1.6 紫外线(UV)诱变 取2 mL制备好的孢子液放入置有圆形磁片的培养皿中(直径为9 cm),打开预热15 W紫外灯(波长253.7 nm)30 min,将离紫外灯管置于培养皿垂直高度35 cm处,然后打开皿盖,分别采用照射20、40、60、80 s进行处理,盖上皿盖,诱变处理过程在黑暗条件下进行。诱变结束后,再将培养皿在黑暗处条件下放置2 h,然后吸取孢子液,均匀涂布于分离培养基上,于32 ℃培养箱中培养7 d,统计致死率。

1.7 常压室温等离子体(ARTP)诱变 ARTP的工作气体为纯度为99.99%的氦气,处理功率为80 W,等离子体发生器待处理样品与出口之间的距离为4 mm,气体的流量9.0 L/min。将准备好的50 μL孢子液均匀涂布于载片上,然后进行照射,照射的时间分别为0(对照)、20、40、60、80 s,用50 μL 无菌水冲洗,将照射后的菌液洗脱倒入平皿中,反复洗脱4次,均匀涂布在平皿中,在32 ℃培养箱中培养7 d,统计致死率。

1.8 致死率和正突变率 每个诱变处理36培养皿,重复3次,以未经诱变处理的孢子液为对照,致死率等于(对照处理平皿菌落-诱变处理平皿菌落)/对照处理平皿菌落×100%;正突变率等于诱变处理效价高于对照3%的菌株数/诱变处理的菌株总数×100%。

1.9 菌株遗传稳定性测定 将选育出的高产菌株以斜面形式保存,产生孢子后取少许孢子转入另一斜面,此为一代,连续传代 3次,使用摇瓶检测法测定每一代菌株的红霉素效价,分析其遗传的稳定性。

1.10 红霉素碱耐受性的检测 将孢子液稀释后,分别均匀涂布在含有500、1000、1500 mg/L红霉素碱的培养基上,于32 ℃培养箱培养7 d,观察菌株的红霉素碱耐受性。

1.11 红霉素含量测定 参考张立军等[16]的方法测定。

1.12 酰基辅酶A合成酶活力测定 参考卞晨光等[12]的方法测定。

1.13 正丙醇对发酵的影响 分别向发酵培养基中添加0.5%、1%、1.5%浓度的正丙醇,分析不同浓度正丙醇对发酵效价的影响。

1.14 豆油对发酵的影响 分别向发酵培养基中添加0.05%、0.1%、0.15%浓度的豆油,分析不同浓度豆油对发酵效价的影响。

1.15 中试发酵培养基优化 在中试发酵培养基中分别添加1%正丙醇、0.1%豆油,以及同时加入1%正丙醇和0.1%豆油,分析不同添加物对发酵效价的影响。

1.16 数据分析 所有处理数据采用SPSS 26.0软件进行分析,以t-检验检测差异显著性。

2 结果与分析

2.1 原始菌株的复壮筛选 将引进保存的7株产红霉素的红色糖多孢菌菌株进行复壮,经过传代3次,结果发现编号SE-2207菌株发酵效价较高,为6668 mg/L,且该菌株遗传稳定性较好,作为后续诱变处理的原始菌株(表1)。

表1 原始菌株的效价及遗传稳定性Tab 1 Potency and inheritance stability of the rejuvenation strains

2.2 EMS诱变处理 SE-2207菌株经EMS诱变处理,结果发现随着处理时间的增加,菌体致死率呈现升高的趋势,处理时间为3 h时,致死率为72.5%,正突变率为16.6%;处理时间为5 h时,致死率最高,达到95.2%,正突变率为11.2%,见表2。综合考虑,确定诱变处理适宜时间为3 h。采用EMS诱变处理3 h,初筛出18株正突变菌株,经摇瓶效价检测复筛,得到3株效价升高的菌株(编号为SEM-1、SEM-2、SEM-3),其效价分别为7422、7192、7127 mg/L。

表2 不同诱变方法诱变效果的比较Tab 2 Comparison of mutagenic effects of different mutagenic methods

2.3 UV诱变处理 SE-2207菌株经UV诱变处理,结果发现随着处理时间增加,菌体致死率呈现升高的趋势,处理时间60 s时,致死率为69.3%,正突变率为22.7%;处理时间为80 s时,致死率最高,达到82.1%,正突变率为10.3%。综合考虑,确定诱变处理适宜时间为60 s,见表2。采用UV诱变处理60 s,初筛出21株正突变菌株,经摇瓶效价检测复筛,得到3株效价升高的菌株(编号为SEM-4、SEM-5、SEM-6),其效价分别为7376、7356、7287 mg/L。

2.4 ARTP诱变处理 SE-2207菌株经ARTP诱变处理,结果发现随着处理时间增加,菌体致死率呈现升高的趋势,处理时间60 s时,致死率为71.5%,正突变率为19.5%;处理时间为80 s时,致死率最高,达到82.1%,正突变率为10.3%。综合考虑,确定诱变处理适宜时间为60 s,见表2。采用ARTP诱变处理60 s,初筛出16株正突变菌株,经摇瓶效价检测复筛,得到2株效价升高的菌株(编号为SEM-7、SEM-8),其效价分别为7656 mg/L、7731 mg/L。

2.5 优良菌株遗传稳定性的检测 对获得的效价升高菌株的遗传稳定性进行检测,结果发现菌株SEM-1、SEM-3、SEM-4、SEM-7的遗传稳定性较好,其中,SEM-7效价最高,达到8368 mg/L,较原始菌株SE-2207提高了25.5%(表3)。

表3 优良菌种遗传稳定性分析Tab 3 Inheritance stability analysis of the excellent strains

2.6 优良菌株红霉素耐受性检测 对菌株SEM-1、SEM-3、SEM-4、SEM-7的红霉素耐受性进行检测,结果发现,与原始菌株相比,SEM-7在含500、1000、1500 mg/L红霉素碱的培养基上均能较好生长,表明SEM-7菌株具有较好的红霉素耐受性(表4)。

表4 优良菌种红霉素耐受性检测Tab 4 Erythromycin tolerance test of excellent strain

2.7 SEM-7菌株酰基辅酶A合成酶活力检测 以原始菌株SE-2207为对照,对菌株SEM-7的酰基辅酶A合成酶活力进行检测,结果发现菌株SEM-7酰基辅酶A合成酶活力为31.6 U/mg,较原始菌株提高了19.6%(表5)。

表5 SEM-7菌株酰基辅酶A合成酶活力检测Tab 5 Activity of acyl-CoA synthetase in excellent strain

2.8 正丙醇对SEM-7菌株发酵效价的影响 测定添加不同浓度正丙醇发酵液的效价,结果发现,添加1%正丙醇的效价最高,为8757 mg/L,添加0.5%、1.5%正丙醇的效价分别为8421、8322 mg/L,而未添加正丙醇(无正丙醇)的效价为8298 mg/L,添加1%正丙醇的效价显著高于其他三者(P<0.05),且其他三者之间无显著差异(P>0.05)(图1)。

图1 添加不同浓度正丙醇SEM-7发酵效价(不同小写字母表示效价存在显著差异(P<0.05),下同)Fig 1 Fermentation potency of SEM-7 with different concentrations of n-propanol

2.9 豆油对SEM-7发酵效价的影响 测定添加不同浓度豆油发酵液的效价,结果发现,添加0.1%豆油的效价最高,为8893 mg/L,添加0.05%、0.15%豆油的效价分别为8631、7922 mg/L,而未添加正丙醇的效价为8311 mg/L,添加0.05%、0.1%浓度正丙醇的效价显著高于未添加的(无豆油)(P<0.05),但添加0.15%的效价有所降低(图2)。

图2 添加不同浓度豆油SEM-7发酵效价Fig 2 Fermentation potency of SEM-7 with different concentrations of soybean oil

2.10 SEM-7中试发酵条件优化 综合上述结果,在中试发酵培养基中分别添加1%正丙醇、0.1%豆油,以及同时加入1%正丙醇和0.1%豆油,结果发现,同时添加正丙醇和豆油的效价最高,为9155 mg/L,只添加正丙醇或豆油的效价分别为8734、8792 mg/L,而未添加正丙醇和豆油(无豆油与正丙醇)的效价为8486 mg/L,同时添加1%正丙醇和0.1%豆油的效价显著高于其他三者(P<0.05)(图3)。

图3 不同添加物条件下中试发酵效价Fig 3 The pilot fermentation potency of SEM-7 with different concentrations of additives

3 讨 论

发酵菌种性能对红霉素生产起着极其重要的作用,而诱变选育是获得优良性能菌种的必由途径,EMS、UV和ARTP等诱变方法是常用且行之有效菌种诱变选育手段[17]。本研究采用EMS、UV、ARTP,选育出了高产红霉素的红色糖多孢菌SEM-7。这与刘峰等[8]、赵宏图[11]所采用的诱变方法相一致。在发酵过程中,红色糖多孢菌易受发酵产物红霉素反馈抑制,因此菌株对红霉素的耐受性高低是评价其性能的重要指标。本研究将红霉素耐受性作为菌株选育的前置筛选指标,选育出的优良菌株SEM-7具有较强红霉素耐受性,这与杨雪清等[9]所采用的选育思路及结论类似。红霉素的生物合成起始于丙酰辅酶A,而丙酰辅酶A受酰基辅酶A合成酶活力的调控,有学者的研究结论表明菌株酰基辅酶A合成酶活力可能与红霉素发酵效价存在一定关联[12]。本研究发现菌株SEM-7的酰基辅酶A合成酶活力高于原始菌株,推测这一特性可能对其发酵效价的提高存在一定作用。

刘峰等[8]研究发现,在培养基中补加正丙醇可以大幅提高红霉素发酵效价;沈兆兵等[18]研究发现,在红色糖多孢菌发酵过程中补加豆油可显著提高红霉素产量。本研究也发现,补加正丙醇、豆油可显著提高红霉素产量,且提高作用与补加正丙醇、豆油的浓度相关。本研究还进一步探究了分别补加正丙醇、豆油,以及同时补加正丙醇、豆油对中试发酵的影响,发现同时补加正丙醇、豆油对发酵效价的提高作用更为显著。刘峰等[8]认为正丙醇是内酯环生物合成前体,而红霉素来源于内酯环生物合成途径,在发酵过程中补加正丙醇提高了合成前体物质的浓度,进而提高了红霉素效价。卞晨光等[12]、沈兆兵等[18]分析推测,豆油对红色糖多孢菌产红霉素促进机制是,豆油通过进入菌体的三羧酸循环,生成红霉素另一前体物质2-甲基丙二酰辅酶A,继而提高了红霉素效价。本研究同时补加正丙醇和豆油,对红霉素效价提高作用更强,推测可能是两者的叠加作用所致。

本研究选育出产红霉素的红色糖多孢菌优良菌株SEM-7,并对菌株中试发酵条件进行了初步优化,后续还需对该菌株的性能、生成应用开展更深入的探索。