基于UPLC-Q-Exactive MS技术3种核桃类种仁中甘油酯组成比较

谭文玥, 许梦洋, 柳成航, 王紫嫣, 郭忠仁,3,4,①, 贾晓东,①

〔1. 南京中医药大学, 江苏 南京 210023; 2. 江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园) 江苏省植物资源研究与利用重点实验室, 江苏 南京 210014;3. 中国科学院新疆生态与地理研究所 荒漠与绿洲生态国家重点实验室 干旱区生态安全与可持续发展重点实验室, 新疆 乌鲁木齐 830011;4. 中国科学院新疆生态与地理研究所 伊犁植物园, 新疆 伊犁 835800〕

胡桃(JuglansregiaLinn.)隶属于胡桃科(Juglandaceae)胡桃属(JuglansLinn.),又称核桃,是四大坚果(杏仁、核桃、板栗和腰果)之一[1]。作为胡桃的主要发源地之一,中国具有悠久的栽培历史和丰富的种质资源,并形成了西南、西北和东部3大主要产区[2]。薄壳山核桃〔Caryaillinoinensis(Wangenh.) K. Koch〕隶属于胡桃科山核桃属(CaryaNutt.),又称长山核桃、碧根果,原产于美国和墨西哥,100多年前引入中国,目前在安徽、江苏和云南等地得到大面积栽培[3-4]。山核桃(CaryacathayensisSarg.)也隶属于胡桃科山核桃属,又称浙江山核桃、小核桃,在中国主要分布于浙江和安徽,其中以浙江临安居多[5]。上述3种核桃类植物均为重要的木本油料作物,种仁可鲜食及加工食用,也可榨油。与草本油料相比,木本油料具有天然的营养优势,3种核桃类种仁中均富含油脂、可溶性糖、蛋白质[6]、酚类[7-8]和维生素E[9]等营养物质,其中胡桃种仁含油量在52%～70%之间[10],山核桃种仁含油量高于65%[11],薄壳山核桃种仁含油量在70%左右[12]。已有研究结果表明:核桃类种仁含有丰富的油酸、亚油酸和亚麻酸等健康脂肪酸[13],具有提高记忆力和抗氧化作用[14-15],并对冠心病、高血脂和糖尿病等疾病具有一定改善作用[16-17]。中国居民食用油中木本油料占比远低于发达国家,提高木本油料消费占比、“向森林要粮食”是中国下一步调整油料产业结构和保障粮油安全工作的重点。

甘油酯(glycerolipid,GL)是核桃类种仁中油脂的主要组成部分,占总油脂的95%以上[18],明确甘油酯的组成对于胡桃属和山核桃属植物的育种和栽培及其种仁的营养评价和加工利用等研究都具有重要意义。甘油酯主要包括甘油三酯(triacylglycerol,TAG)和甘油二酯(diacylglycerol,DAG)等。TAG由1分子甘油和3分子脂肪酸结合而成,可为人体储存能量并提供必需脂肪酸。DAG由1分子甘油和2分子脂肪酸结合而成,天然油脂中1,3-DAG及1,2-DAG 2种异构体物质的量比约为7∶3,摄入DAG可改变体内脂质的代谢途径,降低心血管疾病发生风险[19]。由于与甘油结合的脂肪酸种类和位置不同,甘油酯的营养价值存在差异,甘油酯在不同食用油中的组成也存在差异[20]。赵新楠等[21]对植物油中TAG准确定量,得到菜籽油和花生油中主要TAG均为油酸二亚油酸甘油酯,玉米油中主要TAG为二油酸棕榈酸甘油酯。胡谦等[20]比较了油茶籽油和橄榄油的甘油酯组成差异,结果显示油茶籽油和橄榄油中主要TAG均为三油酸甘油酯[20]。

近年来,液质联用技术的飞速发展将代谢物研究带入了组学时代。超高效液相色谱-四级杆-轨道阱高分辨质谱联用(UPLC-Q-Exactive MS)技术结合了超高效液相色谱和高分辨质谱分辨率高、灵敏度强、准确度高等特点,具有很强的碎片离子扫描能力,可快速、准确获得大量代谢物信息,为各种复杂代谢物质的分离鉴定提供了有力的技术支持,在医学、农林科学和药学等领域有强大的应用潜力[22]。如毕玥琳等[23]基于该技术鉴定比较了3种蒿属(ArtemisiaLinn.)植物中化学成分的差异,金重先等[24]应用该技术在芍药(PaeonialactifloraPall.)中鉴定到61个化合物。该技术也被应用于脂质组学的分析,如Li等[25]利用该技术测定并比较了牛奶、豆奶和山羊奶的脂质类型和含量。目前,对核桃类种仁油脂的研究多集中于脂质[26]和脂肪酸[5,27-28]组成的整体分析,对脂质种类的详细分析较少,缺乏对甘油酯的集中比较分析。胡桃属和山核桃属植物的育种方式不断优化,中国的胡桃和山核桃产地面积及产量逐渐增加,且随着中国经济水平上升,人均消费水平及营养意识提高,对优质坚果的需求量扩大,核桃类坚果成为主要消费的木本坚果。引进的薄壳山核桃由于种仁富含油脂、营养价值高,也逐渐进入中国消费者视野,深受市场欢迎。将核桃类种仁添加在混合坚果型休闲食品中,或者单独包装出售成为食品市场的主流,对山核桃、胡桃和薄壳山核桃3种木本油料作物种仁的营养成分进行研究对于其产品深加工及利用具有重要意义。

鉴于此,本研究利用UPLC-Q-Exactive MS技术对山核桃、胡桃和薄壳山核桃种仁中甘油酯的组成成分进行高通量分析,同时对甘油酯组成进行比较,以期为核桃类种仁的采后保鲜及加工技术研究提供科学依据,并为该类坚果油的商品化及推广提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 材料、仪器和试剂

1.1.1 材料 于2021年秋季采集种植于江苏省中国科学院植物研究所实验基地的薄壳山核桃品种‘波尼’(‘Pawnee’)果实,采收后放入冰盒并迅速带回实验室,带回实验室后去除青皮,于35 ℃烘箱中烘至种仁水分含量低于4%。于2021年秋季购买当年新采摘并经过商品化处理的采自新疆的胡桃品种‘纸皮’(‘Zhipi’)和采自浙江的野生山核桃果实,种仁水分含量均低于4%。

1.1.2 仪器 Q-Exactive Plus质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);Nexera LC-30A超高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司);5430R低温高速离心机(美国Eppendorf公司);Acquity UPLC CSH C18色谱柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm,美国Waters公司)。

1.1.3 试剂 乙腈、甲基叔丁基醚(methyltert-butylether,MTBE)、异丙醇和甲醇(分析纯,美国Thermo Fisher Scientific公司);同位素内标单甘油酯(C18∶1)、甘油二酯(C15∶0/C18∶1)和甘油三酯(C15∶0/C18∶1/C15∶0)(美国Avanti公司),混合后溶于甲醇,工作浓度分别为2、10和55 μg·mL-1。

1.2 方法

1.2.1 质控(quality control,QC)样本制备 取相同质量的山核桃、胡桃和薄壳山核桃种仁样本,分别于研钵中粉碎后混合为QC样本,共4个重复,于进样前测试仪器状态及平衡UPLC-Q-Exactive MS系统,并穿插在待测样本检测过程中,对系统稳定性、实验重复性和数据质量可靠性进行全面评价。

1.2.2 样本预处理 3种核桃类种仁分别称取100 g,于研钵中粉碎。每种核桃类种仁7个生物学重复。每个样本取80 mg,加入800 μL MTBE、240 μL预冷(4 ℃)甲醇和200 μL蒸馏水,20 μL混合脂质内标,涡旋混合均匀,置于4 ℃水浴中超声(功率100 W)20 min,室温放置30 min后,于14 000g、10 ℃离心15 min,吸取上层有机相,氮气吹干;在质谱分析前加入200 μL异丙醇-乙腈(体积比9∶1)混合溶液复溶,涡旋混合,取90 μL复溶液,于14 000g、10 ℃离心15 min,取上清液上机分析。

1.2.3 色谱条件 柱温45 ℃,流速300 μL·min-1,流动相A为乙腈-水(体积比6∶4)混合溶液,流动相B为异丙醇-乙腈(体积比9∶1)混合溶液。梯度洗脱:0～2 min,流动相B 30%;2～25 min,流动相B 30%～100%;25～35 min,流动相B 30%。

1.2.4 质谱条件 采用电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)正离子和负离子模式检测,检测条件:蒸发器温度300 ℃,鞘气流量13.5 L·min-1,辅助气流量4.5 L·min-1,扫气流量0.3 L·min-1,喷雾电压3 000 V,离子转移管温度350 ℃,频射透镜50%,MS1扫描范围m/z200～1 800。脂质分子和脂质分子碎片的质荷比采集方法:每次全扫描(full scan)后采集10个碎片图谱(MS2scan,HCD)。MS1在m/z200时分辨率为70 000,MS2在m/z200时分辨率为17 500。

1.3 数据统计与分析

利用LipidSearch软件对脂质分子和混合脂质内标进行峰识别、峰提取和脂质分子鉴定(二级鉴定)等处理。主要参数:前体离子和产物离子的公差为5×10-6,产物离子阈值5%。利用待测物与脂质内标的响应丰度比值(峰面积比)以及脂质内标浓度计算待测物含量。

利用EXCEL 2016和SPSS 26.0软件进行数据处理和多重比较(LSD法,p<0.05),利用SIMCA-P+12.0软件进行主成分分析(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘法判别分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)并计算变量投影重要度(variable important in projection,VIP),利用GraphPad Prism 9软件绘图。

2 结果和分析

2.1 主成分分析

基于甘油酯含量对3种核桃类种仁样品进行主成分分析(PCA),结果(图1)显示:3种核桃类植物21个种仁样本中,20个种仁样本处于95%置信区间内,质控(QC)样本点在PCA图中的分布高度重合,说明实验过程中系统稳定性和数据重复性较好。3种核桃类种仁样本间完全分离,薄壳山核桃和山核桃与胡桃在第1主成分(PC1)上分离,薄壳山核桃与山核桃在第2主成分(PC2)上总体分离,且同种植物的种仁样本聚集在一起。PC1和PC2的贡献率分别占45.88%和13.85%,对于样本分离具有较高的贡献率。薄壳山核桃中有1组数据偏离,故在后续数据分析中剔除。

: 山核桃Carya cathayensis Sarg.; : 胡桃Juglans regia Linn.; : 薄壳山核桃Carya illinoinensis (Wangenh.) K. Koch; : 质控Quality control. 1-7: 各核桃类种仁及质控的重复样本Repeated samples of each kind of walnut kernels and quality control. 椭圆形示95%置信区间The ellipse shows the 95% confidence interval.

2.2 甘油酯组成分析

从3种核桃类种仁中共鉴定出298个甘油酯,分为5个亚类,其中,正离子模式下鉴定到245个甘油三酯(TAG)和38个甘油二酯(DAG),负离子模式下鉴定到1个单半乳糖甘油二酯(MGDG)、9个双半乳糖甘油二酯(DGDG)和5个硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)。

3种核桃类种仁中甘油酯5个亚类含量及总含量见表1。结果显示:3种核桃类种仁的甘油酯总含量以及TAG、MGDG和SQDG含量无显著差异,胡桃和薄壳山核桃种仁的DAG含量显著(p<0.05)高于山核桃,而前二者的DGDG含量显著低于山核桃。

表1 3种核桃类种仁中甘油酯亚类组成

由表1还可见:3种核桃类种仁中TAG均为最主要的甘油酯亚类,在山核桃种仁中的占比最高,占其甘油酯总含量的74.58%;在胡桃和薄壳山核桃种仁甘油酯总含量中的占比分别为58.51%和66.94%。DAG在山核桃、胡桃和薄壳山核桃种仁甘油酯总含量中的占比也较高,分别为25.22%、41.46%和32.98%。MGDG、DGDG和SQDG在3种核桃类种仁甘油酯总含量中的占比均较低。因此,后续分析主要比较TAG和DAG在3种核桃类种仁中的差异。

3种核桃类种仁TAG和DAG亚类中含量排名前10的脂质分子见表2。结果显示:TAG亚类中,TAG(C18∶2/C18∶2/C18∶2)、TAG(C18∶1/C18∶1/C18∶2)(保留时间20.58 min)、TAG(C18∶1/C18∶1/C18∶1)、TAG(C18∶0/C18∶1/C18∶1)、TAG(C18∶3/C18∶2/C18∶2)(保留时间17.45 min)和TAG(C16∶0/C18∶1/C18∶2)的含量在3种核桃类种仁中均排名前10;TAG(C18∶3/C18∶2/C18∶3)和TAG(C16∶0/C18∶1/C18∶3)(保留时间19.30 min)的含量在山核桃和胡桃种仁中排名前10,TAG(C18∶1/C18∶1/C18∶2)(保留时间21.15 min)含量在山核桃和薄壳山核桃种仁中排名前10;TAG(C16∶0/C18∶1/C18∶1)(保留时间21.98 min)含量在山核桃种仁中排名前10;TAG(C18∶3/C18∶2/C18∶2)(保留时间18.01 min)和TAG(C18∶3/C18∶3/C18∶3)的含量在胡桃种仁中排名前10; TAG(C16∶0/C18∶1/C18∶1)(保留时间21.41 min)、TAG(C16∶0/C18∶1/C18∶3)(保留时间19.85 min)和TAG(C20∶0/C18∶1/C18∶1)的含量在薄壳山核桃种仁中排名前10。

表2 3种核桃类种仁甘油三酯(TAG)和甘油二酯(DAG)亚类中含量排名前10的脂质分子

DAG亚类中,DAG(C18∶2/C18∶2)、DAG(C18∶1/C18∶2)、DAG(C16∶0/C18∶2)、DAG(C18∶1/C18∶1)、DAG(C18∶3/C18∶2)、DAG(C16∶0/C18∶1)、DAG(C18∶3/C18∶3)和DAG(C20∶1/C18∶2)的含量在3种核桃类种仁中均排名前10,其中DAG(C18∶2/C18∶2)含量在3种核桃类种仁中均最高;DAG(C18∶0/C18∶1)含量在山核桃和薄壳山核桃种仁中排名前10;DAG(C16∶0/C18∶3)含量在胡桃和薄壳山核桃种仁中排名前10;DAG(C17∶1/C18∶1)含量在山核桃种仁中排名前10;DAG(C16∶1/C18∶3)含量在胡桃种仁中排名前10。

2.3 甘油酯组成差异分析

采用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)比较山核桃、胡桃和薄壳山核桃种仁甘油三酯(TAG)和甘油二酯(DAG)亚类中的差异脂质分子,得到104个变量投影重要度(VIP)大于1的脂质分子,可作为区分3种核桃类种仁的显著差异脂质分子,其中,VIP值排名前10的脂质分子见表3。结果显示:DAG(C17∶1/C18∶1)的VIP值为1.73,其含量仅在山核桃种仁DAG亚类中排名前10;DAG(C18∶1/C18∶2)的VIP值为1.68,其含量在3种核桃类种仁DAG亚类中均排名前10;其他8个VIP值排名前10的脂质分子含量较低。

表3 3种核桃类种仁甘油三酯(TAG)和甘油二酯(DAG)亚类中变量投影重要度(VIP)排名前10的脂质分子

2.4 甘油三酯和甘油二酯的脂肪酸组成

3种核桃类种仁中甘油三酯(TAG)和甘油二酯(DAG)的脂肪酸组成分别见图2和图3。结果显示:3种核桃类种仁中TAG和DAG的脂肪酸主要由饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)、双不饱和脂肪酸(DUFA)及多不饱和脂肪酸(PUFA)组成。TAG中,22种SFA分别为丁酸(C4∶0)、己酸(C6∶0)、辛酸(C8∶0)、壬酸(C9∶0)、癸酸(C10∶0)、月桂酸(C12∶0)、十三烷酸(C13∶0)、十四烷酸(C14∶0)、十五烷酸(C15∶0)、棕榈酸(C16∶0)、十七烷酸(C17∶0)、硬脂酸(C18∶0)、十九烷酸(C19∶0)、花生酸(C20∶0)、二十一烷酸(C21∶0)、山嵛酸(C22∶0)、二十三烷酸(C23∶0)、木质素酸(C24∶0)、二十五烷酸(C25∶0)、二十六

SFA: 饱和脂肪酸Saturated fatty acid; MUFA: 单不饱和脂肪酸Monounsaturated fatty acid; DUFA: 双不饱和脂肪酸Diunsaturated fatty acid; PUFA: 多不饱和脂肪酸Polyunsaturated fatty acid; TAG: 甘油三酯Triacylglycerol; UFA: 不饱和脂肪酸Unsaturated fatty acid. C4∶0: 丁酸Butyric acid; C6∶0: 己酸Hexanoic acid; C8∶0: 辛酸Caprylic acid; C9∶0: 壬酸Nonanoic acid; C10∶0: 癸酸Decanoic acid; C12∶0: 月桂酸Lauric acid; C13∶0: 十三烷酸Tridecanoic acid; C14∶0: 十四烷酸Tetradecanoic acid; C15∶0: 十五烷酸Pentadecanoic acid; C16∶0: 棕榈酸Palmitic acid; C17∶0: 十七烷酸Heptadecanoic acid; C18∶0: 硬脂酸Stearic acid; C19∶0: 十九烷酸Nonadecanoic acid; C20∶0: 花生酸Arachidic acid; C21∶0: 二十一烷酸Heneicosanoic acid; C22∶0: 山嵛酸Behenic acid; C23∶0: 二十三烷酸Tricosanoic acid; C24∶0: 木质素酸Lignin acid; C25∶0: 二十五烷酸Pentacosanoic acid; C26∶0: 二十六烷酸Hexacosanoic acid; C27∶0: 二十七烷酸Heptacosanoic acid; C28∶0: 二十八烷酸Octacosanoic acid; C10∶1: 癸烯酸Decenoic acid; C12∶1: 月桂烯酸Lauroleic acid; C14∶1: 十四碳烯酸Tetradecenoic acid; C16∶1: 棕榈油酸Palmitoleic acid; C17∶1: 十七碳烯酸Heptadecenoic acid; C18∶1: 油酸Oleic acid; C19∶1: 十九碳烯酸Nonadecyenoic acid; C20∶1: 二十碳烯酸Eicosenoic acid; C21∶1: 二十一碳烯酸Heneicosenoic acid; C23∶1: 二十三碳烯酸Tricosenoic acid; C30∶1: 三十碳烯酸Triacontenoic acid; C10∶2: 癸二烯酸Decadienoic acid; C12∶2: 十二碳二烯酸Dodecadienoic acid; C14∶2: 十四碳二烯酸Tetradecadienoic acid; C18∶2: 亚油酸Linoleic acid; C20∶2: 二十碳二烯酸Eieosadienoic acid; C18∶3: 亚麻酸Linolenic acid; C18∶4: 十八碳四烯酸Octadecatetraenoic acid; C20∶5: 二十碳五烯酸Eicosapentaenoic acid. TAG中仅列出占比排名前4的脂肪酸Only the top four fatty acids are listed in TAG.

SFA: 饱和脂肪酸Saturated fatty acid; MUFA: 单不饱和脂肪酸Monounsaturated fatty acid; DUFA: 双不饱和脂肪酸Diunsaturated fatty acid; PUFA: 多不饱和脂肪酸Polyunsaturated fatty acid; DAG: 甘油二酯diacylglycerol; UFA: 不饱和脂肪酸Unsaturated fatty acid. C14∶0: 十四烷酸Tetradecanoic acid; C15∶0: 十五烷酸Pentadecanoic acid; C16∶0: 棕榈酸Palmitic acid; C17∶0: 十七烷酸Heptadecanoic acid; C18∶0: 硬脂酸Stearic acid; C20∶0: 花生酸Arachidic acid; C21∶0: 二十一烷酸Heneicosanoic acid; C22∶0: 山嵛酸Behenic acid; C23∶0: 二十三烷酸Tricosanic acid; C24∶0: 木质素酸Lignin acid; C25∶0: 二十五烷酸Pentacosanoic acid; C16∶1: 棕榈油酸Palmitoleic acid; C17∶1: 十七碳烯酸Heptadecenoic acid; C18∶1: 油酸Oleic acid; C19∶1: 十九碳烯酸Nonadecyenoic acid; C20∶1: 二十碳烯酸Eicosenoic acid; C18∶2: 亚油酸Linoleic acid; C20∶2: 二十碳二烯酸Eieosadienoic acid; C18∶3: 亚麻酸Linolenic acid; C18∶4: 十八碳四烯酸Octadecatetraenoic acid. DAG中仅列出占比排名前4的脂肪酸Only the top four fatty acids are listed in DAG.

烷酸(C26∶0)、二十七烷酸(C27∶0)和二十八烷酸(C28∶0);11种MUFA分别为癸烯酸(C10∶1)、月桂烯酸(C12:1)、十四碳烯酸(C14∶1)、棕榈油酸(C16∶1)、十七碳烯酸(C17∶1)、油酸(C18∶1)、十九碳烯酸(C19∶1)、二十碳烯酸(C20∶1)、二十一碳烯酸(C21∶1)、二十三碳烯酸(C23∶1)和三十碳烯酸(C30∶1);5种DUFA分别为癸二烯酸(C10∶2)、十二碳二烯酸(C12∶2)、十四碳二烯酸(C14∶2)、亚油酸(C18∶2)和二十碳二烯酸(C20∶2);3种PUFA分别为亚麻酸(C18∶3)、十八碳四烯酸(C18∶4)和二十碳五烯酸(C20∶5)。DAG中,11种SFA分别为十四烷酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、二十一烷酸、山嵛酸、二十三烷、木质素酸和二十五烷酸;5种MUFA分别为棕榈油酸、十七碳烯酸、油酸、十九碳烯酸和二十碳烯酸;2种DUFA分别为亚油酸和二十碳二烯酸;2种PUFA分别为亚麻酸和十八碳四烯酸。

由TAG的脂肪酸分析结果(图2)可以看出:山核桃和薄壳山核桃种仁中MUFA含量最高,PUFA含量最低;胡桃种仁中DUFA含量最高,SFA含量最低。山核桃、胡桃和薄壳山核桃种仁的SFA中棕榈酸均为主要组成成分,其次为硬脂酸。3种核桃类种仁的MUFA中主要由油酸组成,DUFA中亚油酸和PUFA中亚麻酸的占比均高于99%。山核桃和薄壳山核桃种仁的TAG中主要脂肪酸为油酸,占比均高于46%;其次为亚油酸,占比均高于29%。胡桃种仁的TAG中主要脂肪酸为亚油酸、油酸和亚麻酸,占比分别为33.83%、26.79%和25.48%。山核桃、胡桃和薄壳山核桃种仁的TAG中SFA和不饱和脂肪酸(UFA)的含量比分别为1∶6.07、1∶7.64和1∶6.38。

由DAG的脂肪酸分析结果(图3)可以看出:在山核桃、胡桃和薄壳山核桃种仁中均为DUFA含量最高,其次为MUFA;山核桃和薄壳山核桃种仁中PUFA含量最低,胡桃种仁中SFA含量最低。3种核桃类种仁DAG中脂肪酸种类的构成相似,SFA中棕榈酸含量最高,MUFA中油酸含量最高,DUFA中亚油酸含量最高,PUFA中亚麻酸含量最高。山核桃、胡桃和薄壳山核桃种仁的DAG中主要脂肪酸为亚油酸,占比均高于57.00%;其次为油酸,占比分别为28.00%、15.37%和30.62%;山核桃和薄壳山核桃种仁的DAG中占比排名第3的脂肪酸为棕榈酸(占比分别为8.88%和7.36%),胡桃种仁的DAG中占比排名第3的脂肪酸为亚麻酸(占比为14.60%)。山核桃、胡桃和薄壳山核桃种仁的DAG中SFA和UFA的含量比分别为1∶9.29、1∶9.87和1∶11.25。

3 讨论和结论

目前对核桃类种仁的研究多数集中于含油率以及蛋白质和脂肪酸等营养物质的含量,少有对甘油酯亚类的报道[6-13]。本研究基于UPLC-Q-Exactive MS技术对山核桃、胡桃和薄壳山核桃3种核桃类种仁的甘油酯亚类构成进行分析,共鉴定到298个甘油酯,包含245个甘油三酯(TAG)、38个甘油二酯(DAG)、1个单半乳糖甘油二酯(MGDG)、9个双半乳糖甘油二酯(DGDG)和5个硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG),其中具有同分异构体脂肪酸的脂质分子均被区分开。3种核桃类种仁中甘油酯亚类按照含量由高到低依次为TAG、DAG、DGDG、SQDG、MGDG,其中TAG和DAG含量的排序与Wang等[29]对胡桃种仁中甘油酯的分析结果一致,而含量较少的亚类含量排序略有差异。Jia等[30]的研究结果表明:随储藏时间延长,薄壳山核桃种仁中TAG含量逐渐降低,而DAG含量则先降低后大幅升高,因此推测储藏时间对研究结果具有一定影响。

甘油酯的结构和组成对油脂性质有影响。本研究中,山核桃和薄壳山核桃种仁TAG亚类中TAG(C18∶2/C18∶2/C18∶2)含量最高,胡桃种仁TAG亚类中TAG(C18∶3/C18∶2/C18∶3)含量最高,且均占各自TAG亚类含量的12%以上。3种核桃类种仁DAG亚类中均为DAG(C18∶2/C18∶2)含量最高,且均占各自DAG亚类含量的34%以上。3种核桃类种仁中TAG和DAG亚类脂质分子间含量差异较大,但分布较为集中,含量排名前5的TAG含量之和占TAG亚类含量的45%以上,而含量排名前5的DAG含量之和占DAG亚类含量的90%左右。已有的研究多是将脂肪酸水解,之后采用气相色谱进行测定,例如:任小娜等[31]和Maguire等[32]利用气相色谱将薄壳山核桃和胡桃与杏仁、花生等油料作物的脂肪酸组成进行比较;贾晓东等[27]利用气质联用技术对山核桃属的薄壳山核桃和山核桃的脂肪酸进行了对比;周张涛等[33]比较了中国不同产区胡桃油组成成分;辛国等[34]和俞春莲等[35]比较了不同品种胡桃和薄壳山核桃的脂肪酸组成。先水解后测定的方式可以明确脂肪酸整体组成,但缺乏甘油酯中的具体取代信息。液质联用技术的应用使得甘油酯的测定更加便利,例如:许培源等[36]采用液质联用技术对薄壳山核桃油中的TAG成分进行分析,共鉴定到7个TAG,主要成分为TAG(C18∶2/C18∶2/C18∶2);Amaral等[37]分析9个胡桃品种的TAG组成,TAG(C18∶2/C18∶2/C18∶2)为这9个胡桃品种主要的TAG,本研究结果与其一致。此外,支虎明等[26]在胡桃种仁中鉴定到207个TAG,其中含量最高的为TAG(C18∶3/C18∶2/C18∶2),其次为TAG(C18∶1/C18∶1/C18∶1);43个DAG中含量最高的是DAG(C18∶2/C18∶2)。廖学焜等[38]分析了山核桃仁油的TAG组成,其主要TAG为TAG(C18∶1/C18∶1/C18∶1)和TAG(C18∶1/C18∶1/C18∶2)。胡桃生长的地理位置和气候条件[39]以及果实采摘时期[40-41]可能是造成上述研究结果存在差异的原因。

核桃类种仁中富含不饱和脂肪酸,尤其是亚油酸和亚麻酸等人体必需脂肪酸[42],在预防炎症、癌症以及心脑血管疾病等方面具有重要作用[43]。Huang等[44]对山核桃不同发育时期的脂质种类进行研究,结果显示:山核桃TAG和DAG中主要的饱和脂肪酸为棕榈酸和硬脂酸,主要的单不饱和脂肪酸、双不饱和脂肪酸及多不饱和脂肪酸分别为油酸、亚油酸和亚麻酸。本研究中,供试3种核桃类种仁中TAG和DAG的碳链所含碳数为4～30,双键数为0～5,主要脂肪酸种类与Huang等[44]和李群等[28]的研究结果一致,均为棕榈酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。山核桃和薄壳山核桃种仁的TAG中,含量最高的脂肪酸均为油酸,其次为亚油酸;胡桃种仁的TAG中,含量最高的脂肪酸为亚油酸,其次为油酸。山核桃、胡桃和薄壳山核桃种仁的DAG中,含量最高的脂肪酸为亚油酸,其次为油酸。此外,胡桃种仁的TAG和DAG中亚麻酸含量略低于油酸含量,但胡桃种仁的TAG和DAG中亚麻酸含量均明显高于薄壳山核桃和山核桃。薄壳山核桃和山核桃的脂肪酸组成更为相似,与二者的系统分类一致。由于本研究未去除3种核桃类种仁的内种皮,不排除内种皮所含脂肪酸的干扰[45]。

甘油酯作为核桃类种仁油脂的主要组成部分,对油脂的品质具有极大影响。国内木本油料的消费量仍在快速上升,未来还需进一步对不同核桃类品种、不同贮藏方式或不同加工技术下种仁甘油酯的差异进行更全面细致的研究。