基于生物信息学探讨葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎的可行性*

惠朋利 朱社教 王成 谢红 沈维艳 王谧 张涛 邹崇伟 高宏君 曾红梅

(安康市中医医院,陕西 安康 710000)

炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一种特发性、慢性、复发性疾病,通常累及回肠、直肠和结肠,包括溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s Disease,CD)[1-2]。临床表现为腹痛、腹泻、粘液脓血便、甚至癌变。尽管目前确切病因及发病机制仍不明确,但现有研究结果认为该病是一种免疫介导的肠道炎症[3-4]。流行病学研究显示UC通常发生在20-30岁的青年人群,但也可见于其他年龄阶段[5-6]。UC治疗原则是控制急性起病,维持病情缓解,减少复发,预防并发症[4-7]。UC的治疗药物包括氨基水杨酸,皮质类固醇和免疫调节剂,但大多数药物在副作用和安全性方面都有很大局限性[8-9]。

近年来,一些学者对中药复方治疗UC的潜在作用机制进行了研究,如芍药汤、半夏泻心汤和乌梅丸等等,已发表的研究结果表明这些复方在改善腹痛和腹泻症状、减轻炎症方面发挥着重要作用[10-11]。葛根芩连汤出自《伤寒论》,主治伤寒表邪未解,误用下法导致表邪里陷、协热下利之证。方中葛根解表邪、清里热、升阳止泻;黄芩、黄连清热燥湿、善清肠胃湿热而厚肠止利;甘草缓急止痛、补益脾胃。王萍丽[10]和王传颂[8]两项临床研究对照组分别采用柳氮磺吡啶和美沙拉嗪为对照组,治疗组在对照组的基础上联用葛根芩连汤,两者的结论均提示葛根芩连汤能够显著提高有效率,缩短黏膜愈合时间。现代药理学研究显示葛根芩连汤能够改善UC大鼠消化道症状、降低炎症因子和5-HT含量[12]。为进一步了解该药治疗UC的作用机制,本研究基于网络药理学分析方法找出其作用靶点及可能的通路。

1 材料与方法

1.1葛根芩连汤化合物及靶点预测 本研究采用TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)对葛根芩连汤中药物的化合物和靶点进行预测,首先将药物名称(葛根、黄芩、黄连、甘草)分别输入检索框,本研究纳入所有检索到的化合物,并将化合物与靶点进行匹配。最后将上述靶点名称输入UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)查询靶点的名称,将靶点的蛋白名称转化为基因名称以方便后续分析。

1.2UC的靶点预测及靶点映射 本研究采用OMIM数据库(https://www.omim.org/search/advanced/geneMap)和DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/search)对UC的靶点进行预测,首先以“Ulcerative Colitis”为检索词分别检索两个疾病靶点数据库,然后将所获得的UC靶点进行汇总并去除重复靶点,最后将1.1中所得GGQL靶点与UC靶点进行映射,即可获得GGQL治疗UC的关键靶点。

1.3关键靶点的基因功能关联网络 本研究采用STRING数据库(https://string-db.org/),首先选择 “multiple proteins”,然后将1.2中所得关键靶点输入搜索框,物种选择“Homo sapiens”,继续下一步操作,即可得到基因功能关联网络。为了更清晰地看到网络中哪些靶点处于核心位置,故将基因功能关联网络数据导入Cytoscape软件并按照节点度值大小对图形进行调整。

1.4GO富集分析和通路富集分析 本研究采用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)进行GO富集分析和通路富集分析,首先将1.2中所得交集靶点输入DAVID数据库,然后将Backgroung和List定义为“Homo sapiens”,最后即可进行富集分析。

2 结果

2.1GGQL化合物及靶点 通过对TCMSP数据库检索,将化合物与靶点一一对应并去除重复靶点,共得到药物的化合物278中,靶点410个。详见图1。然后将其输入UniProt数据库进行名称转化。最后利用R软件VennDiagram程序包对四种药物的靶点绘制韦恩图,共得到交集靶点62个。详见图2。

(红色的节点表示药物,绿色的节点表示化合物,黄色的节点表示药物靶点。)

图2 药物潜在靶标交集

2.2UC靶点及靶点映射 通过对DisGeNET数据库和OMIM数据库的检索,将两个数据库所的UC靶点进行汇总并去除重复靶点后共得到疾病靶点914个。然后利用R软件VennDiagram程序包将GGQL与UC靶点进行映射,共得到交集靶点113个。详见图3。

图3 “药物靶标-疾病靶标”网络

2.3基因功能关联网络 将上述关键靶点导入STRING数据库构建基因功能关联网络,网络中有节点113个,边621条,平均节点度值11。将最小的相互作用分调整为0.7,并隐藏独立的节点。将输出结果中的TSV文件格式导入到Cytoscape软件,然后按照节点度值的大小进行图形绘制,图形中相互作用越多、越重要,并且居于核心位置的靶点图形越大。从图中不难看出IL6、STAT3、IL1B、VEGFA、MAPK1、EGF、PTGS2、EGFR、ICAM1、MMP9等十个节点图形明显大于其他节点,表明这些节点在葛根芩连汤治疗UC中发挥关键作用。图中蓝色的节点表示GGQL靶点与UC靶点交集,紫色的部分表示药物共有靶点与图3所得靶点的交集。详见图4。

图4 基因功能关联网络

2.4GO富集分析和通路富集分析 通过DAVID数据库进行富集分析,其中GO富集分析共聚为16类,涉及89个条目,按照P<0.05和FDR<0.05进行筛选并去除重复值,最终得到有显著意义的条目9条,分别为RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、以DNA为模板的转录正调节、血红素结合、对氨基酸的反应、转录因子结合、核糖核酸聚合酶2转录因子活性以及配体激活的序列特异性脱氧核糖核酸结合、细胞对肿瘤坏死因子的反应、趋药性、参与凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性的激活。而血红素结合、转录因子结合、核糖核酸聚合酶2转录因子活性以及配体激活的序列特异性脱氧核糖核酸结合属于分子功能,其他则属于生物过程。详见图5。通路富集分析共聚为26类,涉及218个条目,按照P<0.05和FDR<0.05进行筛选并去除重复值,最终得到有显著意义的条目17条,其中TNF信号通路、炎症性肠病(IBD)、TLR信号通路、NLR信号通路、JAK-STAT信号通路等通路UC关系密切。详见图6。图5和图6中节点形状越大,表示GO和KEGG条目所富集的靶点数目越多;节点的颜色越红,表示GO和KEGG富集分析的P值越小。

图5 GO富集分析图

3 讨论

UC是一种影响人类健康的慢性复发性胃肠道疾病,根据其症状应属于中医“痢疾、泄泻”的范畴[13]。无论是痢疾还是泄泻,其实都与肠道关系密切,目前研究认为肠道菌群是人体的重要组成部分,肠道菌群与宿主之间存在着相互依存、相互制约的关系[14]。正常情况下,肠道菌群参与宿主消化、营养吸收和免疫调节,保证微生物与宿主的稳定和平衡[15]。然而,肠道微生物群的破坏会诱发包括UC在内的多种疾病的发生[16]。《内经》首先提出“大肠小肠皆属于胃”的说法,脾胃相邻同居于中焦,脾气以升、胃气以降,两者功能正常则胃肠道功能才能协调,二便方可正常[17]。本研究所纳入之葛根芩连汤即是在这一理论指导下的组方,其中方中葛根,入脾胃二经,解表邪、清里热,现代药理学研究认为葛根主要成分为异黄酮类化合物,这些成分具有较强的抗氧化作用,可以提高机体免疫力[18];黄芩味苦性寒,归脾、胃、大肠、小肠经,现代药理学研究认为黄芩主要成分黄芩素和黄芩苷具有抗病毒、抗细菌、抗炎和抗氧化作用,它能够抑制细胞因子的表达促使免疫平衡[19-20];黄连味苦性寒,归脾、胃、大肠经,作用与黄连相同具有清热燥湿、厚肠止利之功,现代药理学研究认为黄连含量最高的化合物小檗碱具有抗菌、抗炎、抗氧化的作用,能够显著抑制血清中炎症因子的表达[21];甘草味甘性平,具有缓急止痛、补益脾胃之效,现代研究认为该药具有较好的抗炎、抗氧化活性[22-23]。总之,UC炎症以及免疫失衡密切相关,而葛根芩连汤中单药均具有较好的抗炎、抗氧化及免疫调节作用,表明该方治疗UC具有较大的实际意义。

本研究基于网络药理学分析葛根芩连汤的作用靶点及其可能的作用机制,对葛根芩连汤治疗UC的113个关键靶点进行基因功能关联网络的拓扑分析,研究结果显示IL6、STAT3、IL1B、VEGFA、MAPK1、EGF、PTGS2、EGFR、ICAM1、MMP9等十个靶点度值较高。进一步查阅文献发现IL6基因编码一种细胞因子,在炎症和B细胞成熟中发挥作用,与炎症反应密切相关[24]。STAT3基因编码的蛋白质是通过对各种细胞因子和生长因子的磷酸化来激活的,这种蛋白调节多种基因对细胞刺激的反应,因此在细胞生长和凋亡等许多细胞过程中起着关键作用[25]。IL1B基因编码的蛋白质是白细胞介素1细胞因子家族的成员,是炎症反应的重要介质,参与多种细胞活动,包括细胞增殖、分化和凋亡[26]。VEGFA基因是PDGF/VEGF生长因子家族的成员,这种生长因子诱导血管内皮细胞的增殖和迁移,对生理和病理血管生成都是必不可少的,其表达与肿瘤的分期和进展有关[27]。MAPK1基因编码MAP激酶家族的成员,MAP激酶是多种生化信号的整合点,通过上游激酶的磷酸化参与细胞增殖、分化、转录调控和发育等多种过程[28]。EGF基因编码表皮生长因子超家族的一个成员,这些蛋白是一种有效的有丝分裂因子,在多种细胞类型的生长、增殖和分化中起着重要作用,并且该基因的失调与某些癌症的生长和发展有关[29]。PTGS是PG合成的关键,它分为两种功能酶,即PTGS1和PTGS2,他们主要分布在胃肠道平滑肌细胞中表达,在炎症刺激的组织中表达并参与炎症反应[30]。EGFR基因编码的蛋白质是一种跨膜糖蛋白,这种蛋白是表皮生长因子家族成员的受体,蛋白质与配体的结合诱导受体二聚化和酪氨酸自磷酸化,并导致细胞增殖,最终可以导致癌症的发生[31]。细胞粘附分子(CAMs)是一大类跨膜蛋白,参与细胞与另一细胞或细胞外基质的结合,在细胞增殖、分化、运动、运输、凋亡和组织结构中起作用,而ICAM1基因编码一种细胞表面糖蛋白,通常在内皮细胞和免疫系统细胞上表达[32]。MMP家族的蛋白质参与正常生理过程中细胞外基质的分解,可能在细胞外基质的局部蛋白水解和白细胞迁移中起重要作用[33]。UC是一种慢性炎症性肠病,结直肠癌是UC的并发症之一,因此这些与炎症相关的关键靶点可能在UC的治疗中也起着关键作用,也可能同时对UC并发癌变具有一定的预防作用[34-35]。

目前UC的体外实验中以NF-kB通路最为多见[36],其次为TLR信号通路[37-38],NLR信号通路[39]和STAT信号通路[40]等等,表明干预NF-kB信号通路在UC的治疗中发挥着重要作用[41]。UC是由于肠道菌群紊乱,慢性炎症反复发作所致,本项研究葛根芩连汤干预UC的网络药理学研究中113个关键靶点不仅富集在包括这四条与UC密切相关的通路上,也富集在其他与炎症有关的通路上,表明葛根芩连汤在UC的治疗具有一定的理论基础。中药成分复杂,通过多靶点、多通路的干预疾病,但是本研究根据富集中的P值和FDR值进行筛选后发现TNF信号通路值最低、富集的靶点最多,据此推测葛根芩连汤可能是通过干预TNF信号通路发挥对UC的治疗作用。