针孔参数优化对激光扫描共聚焦显微镜荧光成像的影响

谢冰花 赵晓枫

摘 要：激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）是一种高分辨率的光学成像仪器，它利用“共轭成像”原理，获得的图片质量远超于普通荧光显微镜。LSCM有两组功能不同的针孔，即照明针孔和探测针孔，这是实现“共轭成像”的关键。由于照明针孔的大小和位置一般是固定的，LSCM主要通过调节探测针孔的大小来获得高质量的成像图片。然而，很多使用者对于LSCM中针孔大小与荧光成像质量的关联缺乏了解。因此，本文阐述了针孔在LSCM中的作用原理及其与显微镜分辨率的关系，并通过小鼠脊髓腹侧白质中的免疫荧光成像分析，发现针孔参数优化对提高LSCM荧光成像质量具有显著影响。这一发现将为LSCM成像分析提供重要参考。

关键词：激光扫描共聚焦显微镜；针孔；分辨率；荧光成像；成像分析

中图分类号：Q-334；Q-336                  文献标志码：A                    DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.01.004

Parameter Optimization for Pinhole on Laser Scanning Confocal Microscopy Fluorescence Imaging

XIE Binghua， ZHAO Xiaofeng*

（Key Laboratory of Organ Development and Regeneration of Zhejiang Province， College of Life and Environmental Sciences， Hangzhou Normal University， Hangzhou 311121， China）

Abstract： Laser scanning confocal microscopy （LSCM） is a high-resolution imaging device. It uses the principle of “conjugate imaging”， the image quality obtained is much higher than that of ordinary fluorescence microscopy. LSCM has two pairs of pinholes， namely illumination pinhole and detection pinhole， which have different function respectively and are the key to realize conjugate imaging. Although the size and position of the illumination pinhole are generally fixed， LSCM can obtain high-quality images by adjusting the size of the detection pinhole. However， there is a lack of knowledge about the link between parameter of pinhole and the higher quality picture for LSCM. Therefore， this paper reveals the principle of pinhole in LSCM and its relationship with resolution. Furthermore， based on immunofluorescence image analysis for specific proteins expression in white matter of mouse spinal cord， we found that optimization for pinhole play an important role in LSCM image quality improving. This study would provide important reference for LSCM imaging analysis.

Key words： laser scanning confocal microscopy; pinhole; resolution; fluorescence imaging; imaging analysis

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（1）： 020-025）

激光掃描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy，LSCM）是上世纪80年代发展并逐渐成熟起来的一种高科技荧光成像仪器［1］。虽然，现代普通荧光显微镜较过去有了长足的发展和进步，但是在对厚度较大的样品（如细胞）进行观察时，来自非焦平面的荧光会对图像整体的分辨率形成较大的干扰。而LSCM的关键技术在于，每次只对空间上的一个点（即焦点）进行成像，再通过计算机控制的逐点扫描形成检测样品的二维或者三维图像。在此过程中，来自焦平面以外的光信号不会对成像形成干扰，从而大大提高了显微图像的清晰度和细节分辨能力［2］。LSCM具有高灵敏度、高分辨率、高放大率等特点［3］，因此被广泛应用于生命科学、医学、材料科学、环境科学等领域［4-6］，是现代微观研究领域不可或缺的利器之一。

根据成像原理，一方面LSCM利用激光作为点光源［7］，激光束（laser）透过照明针孔（illumination pinhole），被二向色镜（dichroic mirror）反射，通过物镜（lens）汇聚后入射于待观察的样本内部焦点（focal plane）处。另一方面，激光照射所产生的荧光，被物镜重新收集后送往二向色镜，携带图像信息的荧光由于波长较长，可直接通过二向色镜并透过探测针孔（detection pinhole）到达光电探测器（detector），通过调节探测针孔的大小和位置，实现点与点成像，即“共轭成像”［8］（图1）。

本文作者在多年的使用和管理LSCM中发现，设置拍照的第一步是将针孔设为1个艾里单位（airy unit，AU），但每次更换物镜或激光器，1 AU针孔的大小都会发生改变，且LSCM的成像质量与针孔大小密切相关。根据这一现象，本文旨在阐明针孔在LSCM中的作用及其与显微镜分辨率的关系，并进一步分析在实际应用中如何利用这一光学原理，获得高质量的成像图片，以期为研究者和使用者提供帮助。

1 针孔的概念及在LSCM中的作用

针孔为一对中央带有小孔的板状结构，二者的几何尺寸一致，约0.1～0.2 μm，是单光子扫描共聚焦显微镜特有的装置。LSCM有两组功能不同的针孔，即照明针孔和探测针孔（图1）。

照明针孔置于激光发射器和光束分离器之间，对光源起到空间滤波和整形作用，形成点光源对样品进行照射，而点光源具有发散小、能量集中等优点，有利于对样品中的荧光物质进行高效激发，进而避免场光源照射时样品中每一点的荧光激发都会受到临近点的衍射或散射光干扰的问题［9］。在实际应用中，照明针孔的大小和位置是固定的。

探测针孔则位于光束分离器和光电探测器之间（图1），只有在焦平面上的点光源所发出的荧光能够通过探测针孔被光电探测元件所接收（图2中绿色光线），而焦平面以外的干扰荧光和散射光不能通过探测针孔［10］（图2中红色光线）。通过调节探测针孔的大小，可以获得高分辨率的理想图片。下文中提到的针孔主要是指探测针孔。

2 针孔与分辨率的关系

显微镜的分辨率通常被描述为可以分辨两个无限小的物体的最小距离，通常是1 AU。1835年，Ariy George Biddell首次提出了衍射现象。艾里斑（ariy disc）是点光源通过理想透镜成像时，由于衍射而在焦点处形成的光斑，中央是明亮的圆斑，周围有一组较弱的明暗相间的同心环状条纹，其中以第一暗环为界限的中央亮斑被称作艾里斑。因此，即使在最优化的状态下，两个无限小的物体距离低于1 AU是不可能被分辨开来的［11］。

1873年，Abbe Ernst Karl发表了自己的理论和公式，并对显微镜的衍射极限进行了解释，即Abbe定律。

横向（即xy轴）分辨率的Abbe衍射公式为：

d横向= λ/（2×NA）（1）

轴向（即z轴）分辨率的Abbe衍射公式为：

d轴向= 2×λ/（NA）2（2）

在光学领域，数值孔径（numerical aperture，NA）定义了镜头可以收集光的能力，代表了一个镜头最基本的物理特性，即：

NA=n×sinα（3）

式中λ是光的波长，n为成像介质的折射率，α是物镜孔径角的一半。

在Abbe衍射极限的基础上，1896年Strutt John William创造了“瑞利判据”理论（Rayleigh Criterrion），在衍射极限系统当中定义了分辨率极限：

R=1.22×λ/（NAobj+NAcond）（4）

式中1.22是一个常系数，NAobj是指物镜的数值孔径值，NAcond為聚光镜的数值孔径值。

由此可知，显微镜的分辨率是由光的波长和数值孔径共同决定的［10］。LSCM的针孔一般指探测针孔，该直径一般自动设置成和艾里斑直径一致，通常设定为1 AU，这样可以有效地过滤掉来自非焦平面的信号，从而获得高分辨率的成像图片。因此，在LSCM使用过程中，每当更换物镜或者激光器时，分辨率都会发生变化，1 AU针孔的大小也随之发生改变（图3）。由图3a可知，以蔡司LSM710为例，在488 nm激光下，物镜镜头倍数越高，数值孔径越大，分辨率越小，相应的1 AU针孔越小（图3b、3c），显微镜分辨能力越强；与之相反，在10×物镜下（图3d），激光波长越长，分辨率越大，1 AU针孔越大（图3e、3f），显微镜分辨率越小。

3 针孔在LSCM中的应用研究

本文作者通过在多年管理和使用LSCM中获得的经验，以蔡司LSM 710为例，简要介绍如何在LSCM中根据不同情况来设置针孔大小，以获得理想的高质量图片。

3.1 设定针孔大小对荧光成像质量的影响

许多使用者不理解针孔在LSCM中的作用，按照普通光学显微镜的操作，只设定电压值，针孔大小始终是软件的默认值，在这种情况下拍摄出来的图片，往往无法达到预期的理想效果。以神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）在P7小鼠脊髓腹侧白质中的免疫荧光拍照为例，从图4可知：在20×物镜下，当针孔小于1 AU时，GFAP的荧光信号虽然清晰可见，但是图片整体强度弱，荧光信号断断续续，损失严重，无法形成连续的完整细胞丝状形态信号（图4a）；而当针孔大于1 AU时，虽然荧光强度得以极大提升，但同时噪音背景也相应增强，图片模糊，使我们无法分辨GFAP的细胞定位情况（图4b）；只有当针孔等于1 AU时，不仅图像信噪比高，还能分辨出清晰的、连续的丝状信号，由此判断GFAP主要在小鼠脊髓腹侧白质的星形胶质细胞中表达［12］（图4c）。因此，应在拍摄前确保针孔大小已设为1 AU。

3.2 多通道拍照中设定每个通道针孔大小的作用

许多使用者在多通道拍摄时，随机设定其中一个通道的针孔为1 AU，而忽略设定其他通道。以转录因子OLIG1在P7小鼠脊髓腹侧白质中的荧光拍照为例，由图5可知，使用者只设定了核染料DAPI通道（405 nm激光）的针孔为1 AU，得到清晰锐利的细胞核结构（图5a、5d）。在图5的拍摄中，OLIG1是Olig1-cre小鼠启动后的转基因番茄红素的荧光信号，该蛋白主要在小鼠脊髓腹侧白质的少突胶质细胞中表达，信号表达强，但背景高。同样在20×物镜条件下，使用者并没有在更换成561 nm激光后重新设定针孔为1 AU，而是按照软件默认值3 AU进行拍照（图5b、5c），得到的图片与针孔为1 AU（图5e、5f）相比，图片模糊，曝光过度，信噪比低。因此，在多通道拍摄时，每次更换镜头或激光器时，应确保每个通道的针孔都设为1 AU。

3.3 针孔大小的优化设置

有些使用者了解针孔在LSCM中的重要作用，但在遇到材料荧光信号较弱拍照时却仍将针孔大小设置为1 AU，由于LSCM的光漂白缺点，无法通过提高激光能量值来获得理想的图片，这样得到的图片不仅质量差，数据也不可靠。根据LSCM成像原理，这时可以将针孔适当调大，允许更多的荧光信号通过探测针孔，得到的效果会完全不同。由图6可知，SOX10非常特异地

在小鼠脊髓腹侧白质的少突胶质细胞中表达［13］，在针孔为1 AU条件下得到的图片荧光信号非常特异但强度弱，许多信号没有被光电探测器收集（图6a、6c）。此时通过将针孔调整为3 AU，不仅图片荧光信号得到了提高，信号数量也较针孔为1 AU时增加了许多，同时，可以清晰地观察到SOX10与细胞核共定位表达（图6e、6f）。因此，在拍照时，遇到荧光信号特异性强而强度较弱时，可适当地增加针孔大小。

4 总结与展望

总的来说，LSCM利用“共轭成像”原理使大部分非焦平面的光都被阻挡，所以拍照时设置的第一要素就是确定针孔的大小，通常设置为1 AU（图4）。由“瑞利判据”可知，不管在何种拍摄条件下，更换物镜或者激光器时，分辨率都会发生改变，因此，都需重新设定1 AU针孔的大小（图5）。在拍摄共定位图片时，相同物镜下，波长越长，分辨率越大，所有针孔应设置成与激光波长最大AU值一致的大小（图2）。针孔大小不仅与LSCM的光学切片厚度有关，还对检测器信号的强度有影响［14-15］。因此，不管是单通道还是多通道拍摄或多维拍摄中，遇到信号较差或是光漂白现象过于严重时，如果增大激光器强度仍未能获得满意的荧光信号，可以将针孔相应地调大，一般可以设置成2～3 AU（图6）［16］。

LSCM由于采用“共轭成像”技术和高精度光电探测器，极大地提高了显微图像的分辨率，而LSCM图像的质量、分辨率等与针孔大小密切相关。从理论上说，LSCM可以对样品任一层面清晰成像即“光学切片”，然而当针孔太小时，允许通过的荧光量减少，无法看清细胞内部物质的正常分布状态；反之，当针孔过大时，光通量也相应增大，z轴分辨率降低，光学切片厚度增大，因此会带来非焦平面光的成分，引起图像模糊和信噪比降低［17-18］。为获得高质量的荧光图片，一般将针孔设为1 AU。由于显微镜分辨率受数值孔径和波长的影响，因此每次切换物镜或更换激光器时，都需重新设定1 AU针孔大小。在图片荧光较弱的时候，为了捕捉到荧光图片，使用者可以适当地调高针孔大小，从而可以进行权衡选择以获得满意的成像图片。

总之，针孔在LSCM的应用中非常重要，是成像的关键，也是最容易忽视的参数。本文总结了针孔在LSCM中的成像原理，分析了改变物镜或激光器需要重新设定针孔大小的原因，并举例说明了在实际应用中如何根据需求设定针孔大小，以期为使用者和广大科研工作者在使用LSCM时理解并掌握针孔的原理提供帮助，并通过在实际应用中灵活设置针孔大小，获得理想的图片，以得到可靠的试验数据结果。

参考文献（References）：

［1］ Bayguinov P O， Oakley D M， Shih C C， et al. Modern laser scanning confocal microscopy［J］. Current Protocols in Cytometry， 2018， 85（1）： e39.

［2］ Elliott A D. Confocal microscopy： principles and modern practices［J］. Current Protocols in Cytometry， 2019， 92（1）： e68.

［3］ 霍霞， 吕建勋， 杨仁东， 等. 激光共聚焦显微镜与光学显微镜之比较［J］. 激光生物学报， 2001， 10（1）： 76-79.

HUO Xia， LYU Jianxun， YANG Rendong， et al. Comparison of laser scanning confocal microscope with light microscope［J］. Acta Laser Biology Sinica， 2001， 10（1）： 76-79.

［4］ 杨子贤， 王洪星， 易小平. 激光扫描共聚焦显微镜在生物科学研究中的应用［J］. 热带生物学报， 2013， 4（1）： 99-104.

YANG Zixian， WANG Hongxing， YI Xiaoping. Future prospects of laser scanning confocal microscope in bioscience［J］. Journal of Tropical Biology， 2013， 4（1）： 99-104.

［5］ 刘向东. 利用激光扫描共聚焦显微镜研究植物细胞发育形态学变化［J］. 激光生物学报， 2007， 16（2）： 173-178.

LIU Xiangdong. A study on the developmental morphology of plant cell by laser scanning confocal microscope［J］. Acta Laser biology Sinica， 2007， 16（2）： 173-178.

［6］ 曾毅波， 蔣书森， 黄彩虹， 等. 激光共聚焦扫描显微镜在微机电系统中的应用［J］. 光学精密工程， 2008， 16（7）： 1241-1246.

ZENG Yibo， JIANG Shusen， HUANG Caihong， et al. Application of laser scanning confocal microscope in micro-elector-mechanical system［J］. Optics and Precision Engineering， 2008， 16（7）： 1241-1246.

［7］ 姜曼， 陶振强， 蒋庭佳， 等. 基于连续扫描方式的激光共聚焦扫描显微镜的研制［J］. 光学仪器， 2013， 35（5）： 52-60.

JIANG Man， TAO Zhenqiang， JIANG Tingjia， et al. Development of laser confocal scanning microscopy based on the continuous scanning method［J］. Optical Instruments， 2013， 35（5）： 52-60.

［8］ 朱廷彬， 郭周义. 激光共聚焦扫描显微镜的光学特性研究［J］. 光学仪器， 1994， 16（3）： 11-19.

ZHU Tingbin， GUO Zhouyi. Research on the optical characteristics of laser scanning confocal microscope［J］. Optical Instruments， 1994， 16（3）： 11-19.

［9］ 罗刚银， 王弼陡， 缪鹏， 等. 激光共聚焦近红外荧光扫描系统光学设计［J］. 应用光学， 2015， 36（1）： 29-34.

LUO Gangyin， WANG Bidou， MIAO Peng， et al. Optical design of near infrared fluorescence confocal laser scanning system［J］. Journal of Applied Optics， 2015， 36（1）： 29-34.

［10］ 张洪飞， 谈梦科， 及少勇， 等. 共聚焦激光扫描显微镜系统光学设计［J］. 光学仪器， 2016， 38（3）： 221-225.

ZHANG Hongfei， TAN Mengke， JI Shaoyong， et al. Optical design of laser confocal scanning microscopy［J］. Optical Instruments， 2016， 38（3）： 221-225.

［11］ 孙学俊， 闫喜中， 郝赤. 激光共聚焦扫描显微镜技术简介及其应用［J］. 山西农业大学学报（自然科学版）， 2016， 36（1）： 1-9.

SUN Xuejun， YAN Xizhong， HAO Chi. Laser confocal scanning microscopy， a general guideline and it applications［J］. Journal of Shanxi Agricultural University （Natural Science Edition）， 2016， 36（1）： 1-9.

［12］ Eng L F， Ghirnikar R S， Lee Y L. Glial fbrillary acidic protein： GFAP-thirty-one years （1969–2000）［J］. Neurochemical Research， 2000， 25： 1439-1451.

［13］ Kuhlbrodt K， Herbarth B， Sock E， et al. Sox10， a novel transcriptional modulator in glial cells［J］. Journal of Neurosci， 1998， 18（1）： 237-250.

［14］ KELLER H E. Objective lenses for confocal microscopy［M］. New York： Plenum Press， 2006（3）： 145-161.

［15］ WILSON T. Resolution and optical sectioning in the confocal microscope［J］. Journal of Microscopy， 2011， 244（2）： 113-21.

［16］ DIASPRO A， ANNUNZIATA S， RAIMONDO M， et al. A single pinhole confocal laser scanning microscope for 3-Damaging of biostructures［J］. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine， 1999， 18： 106-110.

［17］ 李葉， 黄华平， 林培群， 等. 激光扫描共聚焦显微镜的基本原理及其使用技巧［J］. 电子显微学报， 2015， 34（2）： 169-176.

LI Ye， HUANG Huaping， LIN Peiqun， et al. The fundamentals and techniques in laser scanning confocal microscopy［J］. Journal of Chinese Electron Microscopy Society， 2015， 34（2）： 169-176.

［18］ Paddock S W， Eliceiri K W. Laser scanning confocal microscopy： history， applications， and related optical sectioning techniques［J］. Methods in Molecular Biology， 2014， 1075： 9-47.

收稿日期：2022-10-05；修回日期：2022-10-24。

基金项目：国家自然科学基金面上项目（32070965）；杭州市“131”人才计划支持项目。

作者简介：谢冰花，实验师，主要从事中枢神经系统早期发育机制的研究，以及大型仪器设备的使用与管理。

* 通信作者：赵晓枫，副教授，主要从事中枢神经系统少突胶质细胞发育、髓鞘化及其相关疾病分子机制的研究。E-mail： zane@vip.sina.com。