Galectin-9、Cadherin-11在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理特征及预后的关系

童小华,王菁菁

1.商洛职业技术学院附属医院/商洛国际医学中心医院病理科,陕西商洛 726000;2.陕西省安康市中心医院感控科,陕西安康 725000

胰腺癌是起源于胰腺外分泌腺的消化系统恶性肿瘤,因其极高的恶性程度及病死率,被称为“癌中之王”。近年来,胰腺癌发病率日益攀升,但随着诊疗技术进展,该病生存率并未得到明显改善[1]。胰腺癌起病隐匿且发展迅速,多数患者就诊时已处于中晚期,错过了根治性手术机会,多以姑息性化疗为主[2]。近年来,新辅助治疗,如新辅助放化疗、分子靶向治疗、免疫治疗等在胰腺癌治疗中应用越来越多,被认为在降低患者肿瘤分期、缩小病灶、减小血管侵犯等方面有积极意义,这也为胰腺癌预后改善带来了希望[3]。与此同时,探讨新的生物标志物以预测胰腺癌预后、指导临床新辅助治疗等也备受关注[4]。半乳糖凝集素-9(Galectin-9)是一种具有趋化嗜酸性粒细胞功能的β-半乳糖苷结合蛋白,其广泛表达于多种生物组织中,可参与免疫炎症反应、细胞聚集和黏附、肿瘤细胞侵袭和转移等多种生物学行为调节,被认为与恶性肿瘤的发生和发展有关[5]。钙黏蛋白-11(Cadherin-11)是一种参与细胞与细胞黏附作用的Ⅱ型经典钙黏蛋白,已有研究发现其可能与肿瘤细胞多种信号通路调节及肿瘤侵袭转移有关[6]。不过目前关于胰腺癌组织中Galectin-9、Cadherin-11蛋白表达及其临床意义尚不明确,为此本研究通过免疫组织化学法检测胰腺癌组织中Galectin-9、Cadherin-11蛋白表达,并分析其与患者临床病理特征及预后的关系,旨在为胰腺癌的发生和发展机制分析及预后评估等提供新思路,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2019年1月至2021年12月商洛职业技术学院附属医院107例胰腺癌患者癌组织及癌旁组织(距癌组织边缘>2 cm)标本。纳入标准:(1)患者均经术后病理检查证实为胰腺导管腺癌;(2)术前无任何放化疗或其他辅助治疗;(3)临床、病历资料完善;(4)术后均取得预后随访。排除标准:(1)肿瘤复发患者;(2)合并其他部位原发性肿瘤患者;(3)患严重免疫系统疾病、内分泌疾病患者;(4)缺乏足够可用于免疫组织化学分析的组织标本。107例患者中男59例,女48例;年龄36～73岁,平均(60.42±8.84)岁;肿瘤部位:胰头64例,胰尾43例;肿瘤分期[7]:Ⅰ期24例,Ⅱ期38例,Ⅲ期34例,Ⅳ期11例;分化程度:高分化9例,中分化54例,低分化44例;伴淋巴结转移58例,无淋巴结转移49例。所有患者术前对肿瘤标本使用均签署知情同意书。本研究经商洛职业技术学院附属医院医学伦理委员会审核批准。

1.2方法

1.2.1仪器与试剂 主要仪器:免疫组织化学抗原修复盒、孵育盒均购自福州迈新生物科技开发公司,显微镜及成像系统购自日本奥林巴斯公司。主要试剂:兔抗人Galectin-9单克隆抗体、兔抗人Cadherin-11单克隆抗体均购自美国CST公司;即用型免疫组织化学检测试剂盒、DAB显色剂、EDTA抗原修复液均购自福州迈新生物科技开发公司;磷酸盐缓冲液(PBS)购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2.2免疫组织化学染色步骤 将准备好的石蜡切片常规脱蜡、水化,采用EDTA修复抗原,然后阻断过氧化氢酶,先加封闭液,然后分别滴加一抗、辣根过氧化物酶标记物二抗孵育,采用DAB显色后,切片行苏木素复染5 min,再次梯度乙醇脱水,以中性树胶封片,晾干,显微镜下观察。以已知阳性标本作为阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3免疫组织化学染色评价标准 完成染色的切片先于低倍镜下观察整体染色,寻找合适的视野,再于400倍镜下选取5个视野计数,各视野≥100个细胞,观察切片染色强度及染色细胞数。本研究中Galectin-9蛋白以细胞质着色为主,Cadherin-11蛋白以细胞膜着色为主,阳性着色呈棕色或黄色颗粒。(1)染色程度:染色程度可分为无着色、淡黄色、棕黄色、黄褐色,分别计0、1、2、3分;(2)阳性细胞数:阳性细胞数≤5%、6%～25%、26%～50%、>50%分别计0、1、2、3分。染色程度计分×阳性细胞数计分在0～1分为阴性(-),2～3分为弱阳性(+),4或6分为中等阳性(++),9分为强阳性(+++),其中≥2分均视为阳性,否则视为阴性。染色结果由2名具有丰富经验的病理科医生通过双盲阅片进行判断,结果不一致时协商达成一致。

1.2.4随访 患者采用电话和门诊随访形式,第1年内每个月随访1次,其后每2～3个月随访1次,随访时间截至2021年12月,统计患者总生存期。总生存期定义为自诊断日起至任何原因所致死亡或至随访截止时间的时间间隔。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0统计软件进行数据分析处理。计数资料以例数或百分率表示,组间比较采用χ2检验,等级资料比较采用秩和检验;采用Kaplan-Meier生存曲线进行生存质量分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1胰腺癌组织与癌旁组织中Galectin-9、Cadherin-11蛋白阳性表达比较 胰腺癌组织中Galectin-9、Cadherin-11蛋白阳性合计表达率均低于癌旁组织,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 胰腺癌组织与癌旁组织中Galectin-9、Cadherin-11蛋白阳性表达比较[n(%)]

2.2不同临床病理特征癌组织中Galectin-9、Cadherin-11蛋白阳性表达比较 不同肿瘤最大径、肿瘤分期、淋巴结转移癌组织中Galectin-9蛋白阳性合计表达率比较,差异均有统计学意义(P<0.05);不同肿瘤最大径、分化程度、肿瘤分期、淋巴结转移、脉管浸润、神经浸润癌组织中Cadherin-11蛋白阳性合计表达率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同临床病理特征癌组织中Galectin-9、Cadherin-11蛋白阳性表达比较[n(%)]

2.3Galectin-9、Cadherin-11蛋白表达与预后的关系 随访时间截至2021年12月,107例患者死亡71例,继续生存36例,总生存期3～52个月,平均(20.46±10.60)个月。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示,Galectin-9阳性患者累积生存率为34.0%,与Galectin-9阴性患者的33.3%比较,差异无统计学意义(Log Rankχ2=0.418,P=0.518,见图1;Cadherin-11阳性患者累积生存率为43.9%,明显高于Cadherin-11阴性患者的15.6%,差异有统计学意义(Log Rankχ2=10.796,P<0.001),见图2。

图1 胰腺癌组织中Galectin-9蛋白表达的生存曲线

图2 胰腺癌组织中Cadherin-11蛋白表达的生存曲线

3 讨 论

胰腺癌病因至今尚未明确,一般认为可能与长期大量吸烟、饮酒、糖尿病、慢性胰腺炎、长期化学物质接触及遗传因素等有关[8]。有研究显示,胰腺癌5年生存率仅为8%左右,早期诊断和治疗是改善胰腺癌预后的关键,但是因为胰腺癌早期症状体征并不典型,并且胰腺位于人体较深的位置,胰腺癌早期很难被发现,临床上近80%的患者就诊时已处于晚期[9]。近年来,随着胰腺癌基础研究领域进展,“基础-临床”转化有可能为突破胰腺癌的诊疗现状带来契机[10],其中探讨与胰腺癌发生、发展及预后有关的生物标志物是临床研究的热点之一。

Galectin-9为重复串联的半乳糖凝集素,对β-半乳糖苷亲和力很高,正常情况下其在肝脏、肾脏、小肠、胸腺等多种组织器官中广泛分布,可参与机体不同病理生理状态下的免疫调节[11]。近年来有研究指出,Galectin-9在多种恶性肿瘤中呈低表达,并且与肿瘤分期、预后有关。如CHOI等[12]报道指出,胃癌患者Galectin-9阳性表达者总体病死率较阴性表达者降低,Galectin-9阳性表达可能抑制胃癌肿瘤进展;王辉等[13]报道指出,口腔鳞状细胞癌组织Galectin-9阳性表达率明显较口腔扁平苔藓和正常口腔黏膜组织下降,且与口腔鳞状细胞癌分化程度、淋巴结转移有关。当前关于Galectin-9抗肿瘤机制也有一些研究,如Galectin-9可通过减少血管内皮生长因子受体3、胰岛素样生长因子-1受体磷酸化来调节内皮细胞活化,继而影响肿瘤血管生成[14];Galectin-9可通过结合肿瘤细胞表面多糖,直接发挥凋亡效应,还能通过调节肿瘤免疫来抑制肿瘤发展[15]。有报道认为,Galectin-9可能促进肿瘤发展,如NAKAJIMA等[16]研究指出,肿瘤细胞Galectin-9表达可能通过降低抗肿瘤免疫参与皮肤T淋巴细胞瘤进展。Galectin-9目前在胰腺癌中的报道较少见,本研究发现,胰腺癌组织中Galectin-9蛋白阳性合计表达率较癌旁组织降低,且与肿瘤最大径、肿瘤分期、淋巴结转移有关,提示Galectin-9低表达可能与胰腺癌的发生和发展有关,与王武[17]报道相反,这一结果可能受免疫组织化学取材、操作等影响,后期可补充目的基因PCR和蛋白质免疫印迹试验进一步验证。本研究结果显示,Galectin-9表达与胰腺癌患者累积生存率无明显关系,提示其检测对胰腺癌预后判断价值有限。

Cadherin-11是与细胞-细胞黏附作用有关的膜蛋白,于成骨细胞中被发现,被认为与成骨细胞分化有关,可能参与骨发育和维持[18]。近年来有研究发现,Cadherin-11与恶性肿瘤有关,但其在不同类型癌症中的抑癌或致癌功能报道不一。如YUAN等[19]研究发现,Cadherin-11在结直肠癌中表达下调,其可诱导细胞周期阻滞在G0/G1期和凋亡,并通过影响核因子κB信号通路来抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭等过程,被认为是结直肠癌中的一种功能性肿瘤抑制基因;SATRIYO等[20]研究指出,Cadherin-11可通过下调β-连环蛋白,使经典Wnt信号通路失活,从而抑制三阴性乳腺癌干细胞样表型和肿瘤生长;而WANG等[21]研究发现,胃癌肿瘤组织Cadherin-11呈高表达,且与胃癌进展和不良预后有关。本研究发现,胰腺癌组织中Cadherin-11蛋白阳性合计表达率较癌旁组织降低,且与肿瘤最大径、分化程度、肿瘤分期、淋巴结转移、脉管浸润、神经浸润有关,提示Cadherin-11低表达可能与胰腺癌的发生和发展有关。不过目前Cadherin-11表达下调与胰腺癌的发生和发展机制并不明确。E-钙黏蛋白是维持细胞间连接作用的跨膜糖蛋白,其表达缺失可使细胞与细胞及细胞基质间连接能力下降,使细胞发生转移。既往有研究发现,E-钙黏蛋白在胰腺癌组织中表达下调,且与胰腺癌发生、转移有关[22]。有文献指出,下调Cadherin-11表达后,细胞E-钙黏蛋白表达也下调,这可使细胞间黏附能力下降,侵袭能力增强[23]。结合之前研究结果,推测Cadherin-11表达降低可能通过下调E-钙黏蛋白表达参与胰腺癌的发生和发展。本研究还发现,Cadherin-11阳性患者累积生存率高于阴性患者,提示Cadherin-11表达下降可能与胰腺癌不良预后有关。秦雯等[24]报道指出,E-钙黏蛋白表达下降可能参与胰腺癌的发生和发展,在一定程度上支持本研究结果;但BIRTOLO等[25]研究发现,人类慢性胰腺炎和胰腺癌组织中Cadherin-11表达明显升高,与胰腺星状细胞激活和胰腺癌转移有关,这与本研究结果恰好相反,但其原因未知,后期可补充目的基因PCR和蛋白质免疫印迹试验进一步验证。

鉴于Galectin-9、Cadherin-11在不同恶性肿瘤中致癌或抑癌作用报道不一,且本研究结果与同类研究结果并不完全一致,关于Galectin-9、Cadherin-11表达与胰腺癌的关系及其是否可作为胰腺癌预后预测指标仍有待后期多中心、大样本研究进一步探讨。

综上所述,胰腺癌组织中Galectin-9、Cadherin-11呈低表达,且均与胰腺癌临床病理特征表现出一定的相关性,尤其是Cadherin-11蛋白,其阳性表达者较阴性表达者累积生存率明显升高,Cadherin-11检测在胰腺癌预后预测中展现出潜在的应用价值。