超声波辅助热水提取蓝莓多糖的工艺研究

黄 浩

(辽宁铁研种业科技有限公司,辽宁 铁岭 112616)

蓝莓 (VacciniumSpp.),为杜鹃花科越橘属多年生落叶或常绿灌木植物.我国于2000年开始了蓝莓的商业化种植推广,蓝莓种植主要分布于贵州、辽宁、山东、吉林、四川等省.2023年我国蓝莓产量达34.72万吨,其中,鲜果上市量达25.00万吨.蓝莓中除含有大量多糖、蛋白质、维生素、食用纤维等常规营养素以外,还富含酚酸、花青素、熊果苷、紫檀芪等特殊性营养物质[1].蓝莓是一种氧化性强的水果,对衰老、癌症和心脏疾病能发挥抗氧化作用,除此之外,还具有延缓脑神经衰老、增强人体记忆力的功效.蓝莓多糖是蓝莓的一种重要活性成分,具有降压、抗癌、缓解疲劳、清除自由基以及抑制肠道有害菌等功能[2-6].蓝莓鲜果的货架期不超过半个月,不利于运输和贮存,由此限制了蓝莓的推广和食用.因此,将蓝莓用于食品、保健品的加工,不仅利于解决产销不平衡问题,还可提高蓝莓附加值,促进蓝莓产业发展.

多糖的提取、分离纯化是活性研究的基础,目前,提取蓝莓多糖的方法有热水浸提法、碱提取法、酶提取法、超声波辅助法、微波辅助提取法等.国内外研究蓝莓多糖提取的相对较少.热水浸提法是提取多糖最传统的方法,该法简单、容易操作且成本低,但存在耗费时间长、提取率不高的缺点.李颖畅等[7]采用热水浸提法提取蓝莓叶多糖,提取率为29.2 mg/g.碱提取法适宜于提取酸性多糖,时间会缩短但容易含杂质,使多糖降解.DENG等[8]采用碱法提取猫眼蓝莓多糖,提取率为36.02%;王鹏等[9]采用碱浸提法提取蓝莓多糖,提取率为2.181%.酶法、超声波法、微波提取法相较其他方法更为高效,酶法对温度和pH 要求严格,且酶的价格高.孙璐等[10]、孙丽娜等[11]分别采用果胶酶和纤维素酶提取蓝莓多糖,提取率分别为2.721%、2.91%.超声提取高效但有噪声,超声强度过高和时间过长会导致多糖降解.崔笑傲等[12]采用超声辅助纤维素酶提取蓝莓多糖,提取率为8.13%;李敬等[13]、郭丽等[14]利用超声辅助提取蓝莓多糖,提取率达4.93%、5.83 mg/g;孟宪军等[15]以响应面法优化设计微波辅助提取法提取蓝莓多糖,提取率为3.32%.

本文前期预实验研究了超声辅助热水浸提法、碱法、酶法提取蓝莓多糖,发现超声辅助热水提取效果要优于其他方法.而且已报道的响应面优化超声辅助提取蓝莓多糖大多优化的工艺参数是酶解条件,对超声条件的优化相对较少.因此,本文选择市售蓝莓为原材料,经速冻解冻后超声辅助热水提取蓝莓多糖,用苯酚-硫酸法测定多糖含量,通过响应面法优化超声工艺参数,在保障提取完全的同时,有效节约资源与成本,以期为蓝莓多糖的生产和应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓(市售);无水葡萄糖(分析纯,沈阳市试剂三厂);苯酚(分析纯,天津化学试剂有限公司);浓硫酸(优级纯,沈阳化学试剂厂).

1.2 仪器与设备

BCD-190TMPK 冰箱(海尔智家股份有限公司),T6 新世纪紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),2200TH 数控超声清洗器(上海安谱实验科技股份有限公司),SHZ-DⅢ 循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司),DZKW-12-2 电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司),FA1104 型电子天平(上海良平仪器仪表有限公司),80-2 电动离心机(常州市江南实验仪器厂).

1.3 方法

1.3.1 蓝莓多糖的提取 称取一定量速冻后的蓝莓鲜果,于烧杯中以40 kHz、20 ℃、10 min进行超声波解冻[16],解冻后放于干净的研钵中,研磨成浆后准确称取蓝莓浆3.000 g于250.0 mL烧杯中,按1∶10料液比[9-10]加入30.0 mL蒸馏水,搅拌,在80 kHz、50 ℃、40 min进行超声波提取[17],将蓝莓多糖提取液倒入离心管内,以3 000 r/min离心15 min得蓝莓多糖提取液.

1.3.2 蓝莓多糖的测定 采用苯酚-硫酸法[18]测定蓝莓多糖.精确称取无水葡萄糖100.000 mg于烧杯中加蒸馏水溶解,定容至100.0 mL容量瓶,用蒸馏水配制成1.0 mg/mL的葡萄糖溶液.取上述溶液10.0 mL配制成0.1 mg/mL的葡萄糖储备液,分别量取0.1 mg/mL葡萄糖储备液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中,加蒸馏水至2.0 mL,然后分别加入1.0 mL蒸馏水、1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL浓硫酸,摇匀,放入沸水中加热20 min,拿出静置冷却至室温,参考文献[17]中蓝莓多糖最大吸收波长490 nm,并在该波长下测定吸光度值.以葡萄糖含量(μg/mL)为横坐标,吸光度值(A)为纵坐标,绘制标准曲线,求得回归方程为

y=0.013 2x+0.011 9,R2=0.995 7

将测定样液的吸光度值代入回归方程,计算蓝莓多糖的含量.

1.3.3 单因素实验 分别设置超声温度30、40、50、60、70 ℃,超声频率50、60、70、80、90 kHz,超声时间30、40、50、60、70 min,进行单因素实验;取1.0 mL蓝莓多糖提取液于20.0 mL比色管中,加入1.0 mL蒸馏水、1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL浓硫酸,摇匀,放入沸水浴中加热20 min,拿出静置冷却至室温,稀释一定倍数,同时做空白对照,在490 nm吸收波长处测定蓝莓多糖提取液吸光度值,根据葡萄糖标准曲线回归方程,计算样品中多糖含量.

1.3.4 二次回归正交旋转实验 基于单因素实验结果,利用Design-Expert软件进行二次回归正交旋转设计,确定超声温度、超声频率、超声时间3个因素与多糖含量的回归关系.

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声温度的确定 蓝莓多糖经超声温度30、40、50、60、70 ℃,固定超声频率70 kHz和超声时间50 min提取离心后得到样液体积为29.5、29.5、27.0、26.5、19.5 mL.由表1可得,随着超声温度增加,蓝莓多糖含量逐渐增加,当超声温度为60 ℃时,提取的蓝莓多糖含量出现峰值,为984.957 mg/100 g,即9.850 mg/g.继续升高温度,蓝莓多糖含量呈下降趋势,温度过高,氧化剧烈,导致其含量降低,这与徐丽萍等[19]的研究一致.超声温度70 ℃所测定多糖含量低,可能由于温度高导致离心后样液体积减小.因此,选择60 ℃为最佳超声温度.

表1 超声温度确定

2.1.2 超声频率的确定 以 2.1.1得到的最佳超声温度进行提取,固定超声时间50 min,分别以超声频率50、60、70、80、90 kHz提取蓝莓多糖,离心后得样液体积均为24.0 mL.由表2可得,随着超声频率增加,蓝莓多糖的含量先增加后减少,当超声频率70 kHz时,蓝莓多糖含量出现峰值,为1 066.946 mg/100g,即10.669 mg/g.超声频率超过70 kHz时,由于超声频率过高引起多糖糖苷键断裂,这与李敬等[13]和孙希云等[17]的研究一致.实验过程中经单因素多次重复实验验证发现,以频率60、70 kHz测定吸光度值、多糖含量均无明显差异,因此,选择60 kHz为最佳超声频率.

表2 超声频率确定

2.1.3 超声时间的确定 以2.1.1和2.1.2确定的最佳超声温度和超声频率,超声时间30、40、50、60、70 min后提取蓝莓多糖,离心后得样液体积为27.0、25.0、24.5、23.0、19.5 mL.由表3可得,随着超声时间延长,蓝莓多糖含量先升后降,当超声时间为 50 min时,提取蓝莓多糖含量出现峰值,为1 058.610 mg/100 g,即10.586 mg/g.继续延长超声时间,蓝莓多糖在超声作用下发生降解,蓝莓多糖含量逐渐减少,这与李敬等[13]和孙希云等[17]研究一致.根据单因素多次重复实验验证,测定吸光度值在50、60 min时有差异,吸光度值高可能由于时间延长导致提取样液体积变小,但多糖含量在50、60 min时无明显差异,因此,综合考虑选择50 min为最佳超声时间.

表3 超声时间确定

2.2 二次回归正交旋转试验结果

为了优化提取结果,在单因素实验的基础上进行二次回归正交旋转组合设计,实验方案见表4.

表4 三因素二次回归正交旋转组合设计因素水平编码

由表5可知,回归系数为b0、bj、bij、bjj,得初步回归方程

表5 三因素二次回归正交旋转组合设计试验结果

y=945.80+29.92x1-16.40x2+22.45x3-16.71x1x2+51.86x1x3+0.15x2x3+37.61(x12-

0.594)-21.68(x22-0.594)-22.42(x32-0.594)

当x1=1,x2=-1,x3=1时,即超声温度为60 ℃、超声频率为60 kHz、超声时间为60 min时,回归方程算出的预测值为1 080.355 mg/100 g,验证实验得到的值为1 036.080 mg/100 g,求得的变异系数为2.96%.

表6 方差分析

由表7可知,剔除不显著因素后,回归方程高度显著,新的优化回归方程为

表7 简化后回归方程的方差分析

y=975.72+51.86x1x3+37.61(x12-0.594)=953.38+51.86x1x3+37.61x12

该模型预测的最优条件为超声温度70 ℃、超声频率50 kHz、超声时间70 min.结合单因素实验和三因素二次回归正交旋转组合设计试验结果,温度越高、时间越长会造成多糖破坏.确定所对应验证条件是超声温度60 ℃、超声频率50 kHz、超声时间60 min.

2.3 验证实验

将回归正交分析中接近于最大值的三个实验组合、单因素最佳条件、三因素二次回归正交分析结果中的最佳条件一起进行验证,验证实验结果见表8.由表8可知,当x1=1,x2=-1,x3=1时,即超声温度60 ℃、超声频率60 kHz、超声时间60 min,回归方程算出的预测值为1 042.256 mg/100 g,验证实验得到的值为1 036.080 mg/100 g,变异系数为0.42%,其他组合变异系数都大于该值.这5组验证实验中,只有第5组超声频率50 kHz变异系数大于5%,提取率偏低,影响显著;第2、3、4组超声频率为70、80 kHz时,虽变异系数较第1组大,但均不显著,因此,综合考虑选择蓝莓多糖提取的最佳超声温度为60 ℃、超声频率为60 kHz、超声时间为60 min.

表8 验证实验

3 结论

通过单因素及三因素二次回归正交旋转实验最终确定蓝莓多糖提取条件为超声温度60 ℃、超声频率60 kHz、超声时间60 min,在此条件下,提取得多糖含量预测值为 1 042.256 mg/100 g,验证实验值为1 036.080 mg/100 g.通过三因素二次回归正交旋转实验结果分析得到结论,影响蓝莓多糖提取条件因素的主次顺序依次为超声温度、超声时间、超声频率.回归方程y=953.38+51.86x1x3+37.61x12,具有可预测性,拟合性好.