依托咪酯检测方法研究进展

□汪予佳

(西南政法大学,重庆 401120)

随着我国禁毒打击力度的加大,传统毒品供应大幅降低,国内常见毒品货源短缺、价格高涨,毒品买不到、吸不起成为普遍现象。吸毒人员为缓解毒瘾,转而寻求其他麻精药品、新精神活性物质以及未列管的药品进行替代使用,其中包括麻醉药品依托咪酯。为应对依托咪酯滥用和非法制售所造成的危害,国家药监局、公安部、国家卫生健康委员会于2023年9月6日联合发布关于调整麻醉药品和精神药品目录的公告,将依托咪酯(在中国境内批准上市的含依托咪酯的药品制剂除外)列入第二类精神药品目录。此前,已有研究报道通过LC-MS /MS、GC-MS等技术对依托咪酯使用者的血液、尿液、毛发样本进行检测,皆验证了其方法的可行性,这些检测方法研究主要目的是为了监测临床使用中人血浆依托咪酯浓度,用以判断给药剂量和血药浓度范围以保证用药安全。[1-4]而出于法医学或刑事侦查需要的依托咪酯检测方法研究较少,无法满足当前公安禁毒工作的需要。本文针对司法实践需求,总结了现有依托咪酯检测技术的优势和不足,认为在提高检测灵敏度、精简样品前处理程序和开发高通量初筛方法等方面还需要引起更多研究人员的关注。

一、依托咪酯概述

依托咪酯是一种基于咪唑的γ-氨基丁酸A型(GABAA)受体激动剂,用于诱导全身麻醉和镇静。它最初是作为一种抗真菌药物被开发出来,其催眠作用在一次动物实验中被偶然发现。[5]依托咪酯在肝脏和血浆内可被酯酶迅速水解为无活性的羧酸和乙醇,80%的代谢物一般通过尿液和胆汁排出,只有不到2%的药物以原形排出,其中代谢物的主要成分为依托咪酯酸。[6-7]如图1所示,依托咪酯的临床衍生物包括甲氧羰基依托咪酯、[8-9]环丙基甲氧羰基依托咪酯、[10]羰基依托咪酯[11]及ET-26盐酸盐[12]等。

图1 依托咪酯及其临床衍生物结构示意图

在医学临床使用中,依托咪酯已被发现会造成肾上腺抑制、肌阵挛、恶心呕吐、注射疼痛、肌张力反应不良、损害长期记忆能力、氧饱和度下降和心动过缓发作等多种不良反应。[13]而现实案例中被滥用的含依托咪酯成分的毒品,不但所掺依托咪酯含量不明,还经常同时掺杂其他种类毒品或药品,具体组成成分和比例复杂多样,危害性难以判断,因此所引起的生理毒性反应必然较临床使用上更为猛烈。此外,司法实践中发现吸毒者大剂量吸食依托咪酯会引起偏执、焦虑、恐慌、被害妄想症等精神方面的问题,严重者会精神错乱、行为失控,如吸食依托咪酯后自残、伤人或引发交通肇事肇祸等,严重危害群众身体健康和社会安全稳定。[14-15]

二、依托咪酯的检测方法

《吸毒检测程序规定》中明确,吸毒检测包括现场检测、实验室检测和实验室复检。尿液、毛发等生物样本的实验室检测结果属于鉴定意见,是认定吸毒行为的有力证据。在司法实践中,用于依托咪酯现场初筛的尿检试剂盒已经投入使用,但随着列管规定的生效,非法吸食、运输和制贩皆有可能按毒品相关违法或犯罪处理。在这种情况下,不论是检察院的批捕起诉还是法庭的合法审判,都需要对所缴获毒品中依托咪酯的有无、数量、纯度等有明确的定性定量检测结果。

(一)非生物检材中依托咪酯的检测

根据国家药监局网站信息,依托咪酯作为药品,以两种形式被批准,分别为原料药和注射制剂。中国药典(2005版)二部中采用吸收系数法测定依托咪酯注射制剂含量,高效液相色谱法(HPLC)测定依托咪酯,该HPLC法以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇-0.062%醋酸铵溶液(60∶40)为流动相;检测波长为240 nm,柱温为50 ℃。[16]2010年,王发[17]等对药典提供的HPLC检测方法进行细化用以测定依托咪酯注射液,该方法采用十八烷基硅烷键合硅胶柱(150 mm×4.6 mm×5 μm),以0.062%醋酸铵溶液-甲醇(55∶45)为流动相;流速为1.0 mL/min;检测波长为241 nm;柱温为35 ℃,实验结果表明依托咪酯与杂质分离良好,在0.01～10×104mg/mL质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999),线性方程为y=27037.6x-14181.0,方法回收率为99．3%(n=9),相对标准偏差(RSD)为0.6%。2014年,李志琴[18]等进一步改进HPLC检测法对依托咪酯脂肪乳注射液进行定量检测,使用大连伊利特HypersilBDS C18(4.6 mm×250 mm 5 μm)色谱柱,流动相为乙腈-0.01 mL磷酸铵(含1%四丁基溴化铵,磷酸调PH=6.5)(50∶50),流速为1.0 mL/min,检测波长为243 nm,柱温为50℃。实验结果显示依托咪酯在1.6～2.4×105ng/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9997),线性方程y=55.113x-103.4,方法回收率为99.8%(n=9),RSD为0.81%,依托咪酯检测限为0.18 ng。该方法在流动相加入阳离子试剂四丁基溴化铵,样品溶解后可以过滤为澄明溶液,检测峰型更好,依托咪酯与各杂质之间均达到良好分离。《中华药典》更新至2020版后,有关依托咪酯的检测方法依旧沿用通则0512提供的HPLC法。2023年,马雅茹等[19]采用HPLC法测定依托咪酯衍生物甲氧依托咪酯,使用Waters X-SelectC18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm) ,流动相A为 pH 2.0磷酸溶液,流动相B为甲醇和乙腈(5∶100)的混合溶液,实验结果显示甲氧依托咪酯与8种有关物质可完全分离,甲氧依托咪酯的最低检测限为 80 ng/ml。

总体而言,这些检测方法都是基于药典方法操作步骤层面的细化探索,并未涉及新的检测技术或复杂样品检测等方面。司法实践中,依托咪酯在进入非法渠道从上游往下游的流通过程中,会在各环节被添加多种杂质或其他列管物质。如,在所查获的依托咪酯电子烟烟油、烟粉中发现掺有氟胺酮、可卡因、尼古丁、香精等其他成分。现有的检测方法能否应对现实的复杂情况,对掺杂物进行有效分离,开发新的快捷检测方法,则需要研究人员进一步探索。

(二)生物检材中依托咪酯的检测

血液、毛发、尿液是目前毒品检测中最常用的三种生物检材。血液检测具有即时性,准确度高,但样本采集为侵入性,检测程序复杂且成本高。毛发检测可以反映长达数月的吸毒史,但存在一定的延迟性。尿液检测是最常用的检测方法,能够反应一周内的吸毒情况。

1.血液检测

临床医学上对血液检材中存在的依托咪酯及其代谢物进行检测,用以量化药物在体内的作用强度,从而实现监测麻醉效果的目的。自1979年开始,已有关于检测含有依托咪酯血液的方法,其中最常用的是HPLC法。Le[20]采用HPLC法检测血液中依托咪酯的含量,使用十八烷基硅烷键合硅胶柱(25cm×4.6 mm),流动相为乙腈-甲醇-0.025M磷酸盐缓冲液(30∶40∶30)(用28%氨水28%调节pH为8.1),流速设为1.2 mL/min,检测波长为242 nm。实验结果显示依托咪酯在10～200 ng/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9993),线性方程y=0.002768x+0.005956,方法回收率为98±2%(n=9),依托咪酯检测限为5 ng/mL。尽管这一方法已经获得了较高的准确度,但采用该方法检测前需要通过复杂的液液萃取法提取血液中的依托咪酯,操作过程繁琐,且必须在20℃的工作温度下对溶剂进行蒸发干燥,萃取条件高。McIntosh[21]等人改进了血液中依托咪酯的萃取方法,将样品前处理时间缩短到40 min以内,然后采用前述Le等人提供的HPLC法对血液中的依托咪酯进行检测,实验表明依托咪酯在50～5000 ng/mL的浓度范围内呈线性关系(r=0.99),回收率在97%～104%之间,检测限为50 ng/mL。此后,随着联用技术的发展,液质联用分析技术也被应用于依托咪酯检测。Remane[22]等采用超高效液相色谱-串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)提出一种多药物筛选和定量的分析程序,对血浆中的阿芬太尼、盐酸芬太尼、舒芬太尼、依托咪酯、氯胺酮、吗啡和吡硝胺这七种药物进行选择性检测,梯度洗脱采用TFHypesil GOLD苯基色谱柱(100×2.1 mm,1.9 mm),流动相为10 mM甲酸铵水溶液加0.1%甲酸(pH 3.4),流速为500 mL/min。除阿芬太尼和吗啡外,所有药物均获得了准确度较高的定量检测结果,其中以依托咪酯的检测效果最为突出,其检测的低质量控制样品(QCLow)为6.5×104ng/mL,该浓度要远高于正常医疗情况下血液中依托咪酯的含量,且研究也并未展示其所检测药品的最低检测限。Hyesun[23]等将液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)用于分析血液样品中的依托咪酯,依托咪酯10～500 ng/ml范围线性关系良好(r2=0.999),最低检测限为10 ng/mL,依托咪酯在48小时内的回收率在94%～95%之间,7天后的回收率在89%～100%之间,具有较高的稳定性。该方法被成功应用于一例人类尸体血液样本中依托咪酯检测,发现股血中依托咪酯的浓度为110 ng/mL,心脏血中为210 ng/mL。气相色谱法(GC)也与其他精密检测仪器耦合用于血液中依托咪酯的检测。Luhmann等[24]将气相色谱仪与氮磷探测器相联用于检测血液中的依托咪酯。选用25 m×0.32 mm色谱柱,采用氦气为载气,流速为1.6 mL/min。氮气为补充气,流速为2.9×104μL/min,注入器和探测器的温度分别保持在250 ℃和300 ℃,等温分离温度为195 ℃。实验结果显示在0.5～250 ng/mL范围内依托咪酯的峰面积呈良好的线性关系,线性回归方程y=1.056x-3.828(r2= 0.9979),方法回收率为75%。

Xiao等[25]针对依托咪酯的高沸点和高蛋白结合率,提出一种高效率热解吸注入结合脉冲净化的方法,将离子迁移谱(IMS)用于检测血液中的依托咪酯。检测过程如图2所示,实验结果表明在检测浓度0.1～10 ng/μL-1的范围内,信号强度与依托咪酯浓度呈线性相关(r2=0.994),线性方程为y=0.08x+0.06,检测限为0.017 ng/μL-1,RSD<10%。虽然该方法在灵敏度方面稍微逊于色谱法及联用技术,但所达到的定量范围已满足临床医学上依托咪酯的有效血药浓度范围为1.25～3.75 ng/μL-1的监测要求,具有分析时间短、预处理工艺简单、成本较低等优点。

图2 脉冲吹扫热解吸离子迁移率光谱仪示意图

综上所述,有赖于临床医学观察的需要,依托咪酯的血液检测方法得到了一定程度的发展,检测技术相对成熟。但仍然存在样品前处理程序复杂、检测成本高、检测周期长等缺陷;其次,这些检测研究中使用的血液检材主要为空白血样中添加依托咪酯的实验室自制血液样品,没有考虑其代谢物的检测。而在司法实践中毒品检测所面临的个体情况复杂,不但需要考虑代谢物的检测,而且对于检测方法的选择性、抗干扰性、时效性等具有更高的要求。另外,据文献统计分析发现,现有的关于依托咪酯的血液检测的研究主要服务于临床医学对于麻醉药品使用的监测,国内外关于依托咪酯的毒品检测或药物滥用鉴定的专门性研究均较少。

2.尿液检测

依托咪酯在肝脏中被酯酶快速代谢为依托咪酯酸,大部分通过尿液形式排出体内,尿液检材较血液检材更易收集。2019年,Jung等[26]使用LC-MS/MS同时测定尿液中依托咪酯及代谢物依托咪酯酸,该方法选用多孔石墨碳柱(50×2.1 mm,5.0 μm),流动相A 为0.05 %甲酸水溶液,流动相B为50%乙腈∶50%甲醇。该方法不需要采用液-液萃取或固相萃取等任何前处理方式。该方法通过改变流动相、色谱柱和分析条件,在6.5 min内分对尿液样本中的依托咪酯及其代谢物依托咪酯酸进行检测分析,依托咪酯和依托咪酯酸的标准曲线分别在0.40～120.0 ng/mL和1.0～300.0 ng/mL范围内呈良好线性关系,测定系数均大于0.9958,最低检测限分别为0.4 ng/mL和1.0 ng/mL,日内(n=6)和日间(n=24)偏差分别小于10.2%和8.4%。另外,他们对使用过依托咪酯人员的尿液进行检测,验证了该方法的适用性,但具体实验数据尚未在论文中展示。2020年,Huang等人[27]开发出了一种基于DNA-金纳米粒子(AuNP)偶联物的传感器阵列(如图3所示),可以简单快速地检测和识别水溶液和人体尿液中的九种麻醉药物,包括戊巴比妥钠、咖啡因、吗啡、瑞芬太尼、芬太尼、氯胺酮、依托咪酯、卡芬太尼和舒芬太尼。该方法的传感机制是基于DNA-AuNP结合物对每种麻醉药物的不同比色反应,再辅以偏最小二乘法判别析方法用于药物分析,弥补了无法裸眼区分依托咪酯与舒芬太尼的光谱差异的缺陷,使这9种药物的识别准确率达到100%。该研究为开发基于尿液检材的现场即时检测传感器提供了新方向和思路。

图3 三联传感器阵列和化学计量学法测定9种麻醉药品

相较于血液检测而言,尿液检测具有取样方便、样品前处理程序简单、检测周期短等优势,在开发快速和高通量检测技术方面具有更大的研究潜力,关于其在依托咪酯检测中的应用,有待研究人员的进一步探索。

3.毛发检测

吸毒人员通常通过一周不吸食毒品的方式逃避检测,然而毛发里的毒品可以存是3至6个月,是确定长期给药和推算给药时间的最佳生物样本。Park等[28]使用LC-MS/MS法检测毛发中依托咪酯及其代谢物,选用Kinetex®C18柱(50×3 mm,2.6 μm),柱温度保持在30°C。流动相A为水溶液和乙腈(均含2 mM甲酸铵),流动相B为0.2%甲酸,流速为400 μL/min,进样量为3 μl。质谱仪使用电喷雾电离,采用正离子模式扫描,反吹气(CUR)30 psi;离子喷雾电压(IS)5500 V,温度550°C,离子源气体1为60 psi,离子源气体2为40 psi。待测的毛发样本经过蒸馏水和甲醇洗涤以去除可能的污染物,LC-MS/MS检测条件优化后,色谱分离时间缩短为10 min,依托咪酯和依托咪酯酸的线性范围分别为25～50 pg/mg和2～250 pg/mg,r2>0.997,依托咪酯和依托咪酯酸的检测偏差分别在5.36%～8.37%和7.95%～9.88%之间。该方法在低、中、高三个浓度条件下的回收率均高于85%。李雪蕾等[29]采用高效液相色谱-三重四极杆质谱法检测毛发中的依托咪酯,选用电喷雾离子源(ESI)液相色谱柱(100mm×2.1mm 5μm),流动相A为乙腈,流动相B为20 mM乙酸铵和0.1%甲酸缓冲液,流速350 μL/min,正离子扫描模式,电喷雾电压3000 V,离子源温度550 ℃,去簇电压30 V;进样量5 μL,柱温28 ℃。检测结果表明依托咪酯的在 0.1～2.0 ng/mg 的范围内线性良好,r2>0.9991,检出限为0.05 ng/mg。所配制三个浓度(0.1 ng/mg、0.5 ng/mg和2.0 ng/mg)的添加毛发样本的回收率在101.35%～112.74%之间,毛发基质无干扰。采用该方法对公安机关送检的421份涉毒人员毛发和12份实验室技术人员的空白毛发进行检测。实验结果表明,12份空白毛发组均未检出依托咪酯成分,而涉毒人员毛发组中中有115份检出依托咪酯,阳性检出率为 27.3%。该方法为在头发样本中进行依托咪酯检测提供了一个较好的参考。

毛发是非侵入性检材,更易于收集和储存,其中毒品和药物存在稳定,检测窗口期长可达到半年[30]。因此,为应对当前依托咪酯的滥用现状,建立一种使用毛发样本的依托咪酯分析方法在实务取证将具有重要意义。

三、总结与展望

依托咪酯作为传统毒品替代物被滥用的时间较短,毒品检测领域内关于该物质的研究尚未受到广泛关注。被列管后,非法吸食、制贩或运输依托咪酯类产品将构成违法或犯罪,有关依托咪酯的检测需要也必将日益增加。根据司法实务中所面临的现实情况及现有检测技术的发展现状,认为依托咪酯检测技术应加强以下三方面的研究:

(一)不同掺杂物及其他毒品对依托咪酯检测的影响

一方面,市场上非法流通的依托咪酯电子烟类产品中常常掺杂了其他毒品、药品、香精等成分,这些掺杂物可能会对依托咪酯的检测产生干扰。这些掺杂物可能包括一些合成毒品,如MDMA、CBD等,这些毒品可能会与依托咪酯产生相互影响,导致依托咪酯的检测结果出现误差。此外,一些药品如利多卡因、罗红霉素等也可能与依托咪酯发生相互作用,导致检测结果不准确。另一方面,吸毒人员通常存在不同种类毒品混吸的情况,体内可能能够检测出多种毒品成分。这些毒品成分之间可能会相互作用,对依托咪酯的检测产生影响。例如,一些毒品成分可能会改变依托咪酯在体内的代谢过程,导致其在体内的浓度发生变化,从而影响检测结果。因此,这些成分的存在是否会干扰依托咪酯的检测需要引起研究人员的关注。为了解决这个问题,研究人员需要进行深入的研究,了解不同毒品成分对依托咪酯检测的影响,并探索如何准确检测依托咪酯的方法。这有助于保障公共安全,打击毒品犯罪,并为吸毒人员提供更好的治疗康复监管。

(二)依托咪酯的现场高通量检测方法

目前,依托咪酯的检测技术主要基于血液、尿液和毛发等生物检材。其中,血液检测技术的发展较为成熟,起步较早,但前处理程序复杂、检测成本高、检测时间长等缺陷限制了其在现场执法中的应用。相比之下,尿液和毛发检测技术虽然起步较晚,但具有较高的灵敏度和较低的检测成本,因此在现场执法中具有更好的应用前景。然而,目前尿液和毛发检测技术的发展仍存在一些问题。例如,尿液检测的灵敏度较低,可能无法准确检测出低浓度的依托咪酯;而毛发检测的前处理程序较为复杂,需要经过多次洗涤和萃取等步骤才能获得准确的检测结果。因此,开发一种高效、灵敏、低成本的现场高通量检测方法成为了司法实务中的迫切需求。纳米材料传感器的发展为实现这一目标提供了新的研究方向和思路。纳米材料传感器具有高灵敏度、高选择性、低成本等优点,可以实现对生物检材中的依托咪酯进行快速、高效的检测。同时,纳米材料传感器的体积较小,方便携带,可以适用于各种现场环境。

(三)依托咪酯代谢物和衍生物的检测研究

目前,大多数现有的检测技术都未涵盖对依托咪酯代谢物的深入研究,这使得我们在面对现实中的复杂情况时,难以准确应对。在过去的打击非法制售芬太尼类和合成大麻素类毒品的工作中,我们发现非法制毒者为了获得更多类型的毒品以牟取暴利并逃脱法律制裁,很有可能通过改变依托咪酯类物质的空间结构来开发新的衍生物。目前临床上已经开发出多款依托咪酯衍生物,但关于这些衍生物的检测研究尚未受到足够的关注。因此,我们需要针对依托咪酯代谢物和衍生物优化现有的检测方法,或者开发新的检测技术。这不仅有助于有效打击毒品犯罪,也能提高我们在司法实务中的应对能力。综上所述,依托咪酯代谢物和衍生物的检测研究在司法实务中具有极其重要的意义,值得我们投入更多的资源和精力去研究和开发更有效的检测方法和技术。

新兴毒品的检测技术在司法实务和法庭科学研究领域都具有重要的意义。业内研究人员应积极致力于研究开发高效、灵敏的依托咪酯检测方法,以助力公安机关禁毒工作的开展,同时丰富法庭科学研究内容。