剩余污泥热碱脱水过程中胞内外抗生素抗性基因丰度变化分析*

姚鹏城 尤爱菊

(浙江省水利河口研究院(浙江省海洋规划设计研究院),浙江 杭州 310020)

剩余污泥是污水处理系统中生物处理单元的副产物[1],据统计,2019年中国城市剩余污泥产量达到4 000万t[2]。剩余污泥中通常含有大量的有毒有害物质以及抗生素抗性基因(ARGs),如果不进行妥善处理,将对环境造成直接或间接影响。目前,剩余污泥的处理主要分为两大类:处置(填埋、焚烧)和再利用(土壤修复)。而污泥脱水是剩余污泥处理中关键的一环,污泥的含水率需要降低至60%以下[3]。经污水处理系统中污泥脱水机处理后的剩余污泥,其含水率高达80%,无法满足填埋要求,需要进行进一步处理。

研究表明,热碱预处理(TAP)能够有效提高污泥脱水率[4]。与其他高温预处理技术相比,TAP可以有效规避操作风险,并且其能源需求更少,据研究报道,高温和碱性条件能够产生协同作用,促进污泥脱水率的提升[5]196。CAMPO等[6]对加热、热碱等污泥减量技术进行了参数优化,发现在碱性、90 ℃条件下,其污泥脱水率达到32%。ZHENG等[7]通过低温热碱处理剩余污泥,污泥脱水率增加至44.17%。剩余污泥有效脱水的关键限制因素为胞外聚合物(EPS)和细胞壁[8],TAP能够有效破坏细胞壁,溶解EPS,释放细胞内与EPS结合的水分[5]200。

然而,处理后的剩余污泥滤液中,有毒有害物质增加,特别是ARGs,这可能对污水处理系统生物单元和周边生态环境造成潜在风险。ARGs作为一种新兴污染物,受到公众的重点关注[9]。同时,intI 1作为ARGs水平转移的重要介质,与环境中ARGs丰度呈现较高正相关[10]。intI 1通过其特有的3个关键部分(整合酶基因、重组位点和启动子)[11],可以编码抗生素耐药性,实现基因转移[12]。由于污泥脱水后的滤液中残留着大量胞外ARGs(eARGs)和intI 1,通过基因水平转移机制可在微生物群落中迅速扩散[13]。污泥脱水产生的滤液将会回流至生物单元或外溢至环境中,导致ARGs的传播扩散,给微生物或环境生态系统带来巨大的风险。然而,目前剩余污泥脱水产生的滤液对ARGs传播风险鲜有关注。

本研究选择环境中广泛存在的tetA、tetC、sulⅠ、sulⅡ、ermB、dfrA1和dfrA13这7种ARGs及intI 1作为研究对象。探究剩余污泥经过TAP后,其脱水率、胞内ARGs(iARGs)和eARGs丰度变化趋势,并采用响应曲面法(RSM)高效准确地达到参数优化效果,确定TAP最佳工况条件。

1 材料与方法

1.1 样品采集

剩余污泥取自北京某中水回用系统,其生物处理单元为缺氧—MBR工艺,日处理量为1 500 m3/d。缺氧池和MBR膜池水力停留时间分别为3、7 h,污泥质量浓度为9.2～11.2 g/L。污泥样本储存于预先清洗的铝盒中,立刻运至实验室进行试验。

1.2 含水率测定

将定量滤纸放于烘箱中烘至恒重并称质量,记为m1,取质量为m的污泥样品,经过分液漏斗进行固液分离,将滤水后的污泥连同定量滤纸在105 ℃干燥2 h,直至污泥保持恒重,质量为m2。污泥的含水率(ω,%)计算参照式(1)。

(1)

式中:m1、m2和m的单位均为g。

污泥破壁率(D,%)计算参照文献[14],见式(2)。

(2)

式中:ρS1、ρS0、ρT分别为污泥中TAP后可溶性COD(SCOD)、初始SCOD、总COD质量浓度,mg/L。

1.3 胞内和胞外脱氧核糖核酸(DNA)提取及ARGs检测

为了能够更全面、准确地分析ARGs变化趋势,将所有预处理前后样品进行iARGs、eARGs提取。胞内DNA提取:样品通过0.22 μm滤膜进行过滤,截留足够的细胞,保证成功提取DNA。通过PowerSoil DNA分离试剂盒提取样品DNA,并使用NanoDrop 2000超微量紫外—可见分光光度计检测提取DNA的浓度。

本研究中胞外DNA主要通过沉淀法[15]提取,方法如下:将样品置于4 ℃取上清液,将上清液通过0.22 μm滤膜去除残留固体和细胞。取330 mL已过滤溶液加入至726 mL无水乙醇和33 mL 3 mol/L醋酸钠溶液的混合溶液中,将混合溶液置于-20 ℃ 12 h以上,将沉淀后的溶液置于1 000 r/min离心10 min,去除上清液,并风干10 min,干燥后按照PowerSoil DNA分离试剂盒提取样品DNA,并检测DNA浓度。

本研究中,采用SYBR Green Ⅰ法,借助Bio-Rad CFX96荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)仪检测目标ARGs和intI 1,使用的引物如表1所示,反应过程可分为预变、变性、退火和延伸4个部分。20 μL qPCR混合溶液包括10 μL SYBR Premix Ex Taq、2 μL 模板DNA、7.2 μL双蒸水和0.4 μL上下游引物。标准曲线采用已知浓度的标准质粒以10倍梯度稀释获得[16],本研究中标准曲线的相关系数均超过0.99,放大效率为85%～110%。所有qPCR分析样本均重复3次。

表1 目标ARGs与intI 1的引物片段序列Table 1 Premiers sequences of target ARGs and intI 1

1.4 RSM试验设计与数据分析

试验采用RSM中的Box-Behnken设计(BBD)方法对工艺进行优化。由于RSM试验存在拟合误差,本研究采用方差分析对数据进行评估,研究各参数对响应的影响,验证模型的显著性。在试验设计中,选取3个影响因子作为TAP的变量,以污泥脱水率(Y,%)为响应值,试验过程中,自变量范围和水平如表2所示。

表2 试验自变量的范围和水平Table 2 Experimental range and level of the process independent variables

1.5 ARGs去除效率

取污泥上清液,在不同热碱条件下,进行ARGs去除效率(r,%)检测,计算公式如式(3)所示。

(3)

式中:n0、n1分别为反应前、后ARGs浓度(单位为拷贝数/mL)的常用对数。

2 结果与讨论

2.1 TAP的脱水率与工艺优化

2.1.1 方差分析

TAP三因素三水平BBD试验和预测结果如表3所示,TAP污泥脱水率与其试验条件密切相关,试验结果与预测结果较吻合。预测模型(见式(4))的决定系数为0.982 3,p<0.000 1,即98.23%的脱水率变化可以通过方程的自变量解释;变异系数仅为1.78%,说明模型和试验结果的准确性较高;此外,模型的失拟系数小,p=0.441 3,也说明模型准确。反应时间系数、温度系数、pH与温度的相互作用系数以及温度的二次系数均满足p<0.05,说明脱水率可以通过pH、温度和反应时间等变量进行表达。

表3 TAP的BBD试验与预测结果Table 3 Experimental design and results of TAP

(4)

2.1.2 TAP最优条件分析

如图1所示,污泥脱水率与温度、pH之间呈现出明显的交互作用。当pH为11,温度从70 ℃升高至90 ℃时,脱水率从29.91%提高到40.53%。温度保持90 ℃,随着污泥溶液pH从10增加至11,脱水率从31.97%缓慢增加至40.26%,并且随着pH继续升高,脱水率反而呈现下降趋势。此外,污泥脱水率随着反应时间的不断增加而增加。最终,通过RSM,得到TAP反应时间为80 min时,最佳工艺参数为pH=11.2,温度88 ℃,其脱水率高达40.71%。实际操作中,考虑到便捷性,取pH=11,温度为90 ℃。

注:反应时间为80 min。图1 温度、pH与污泥脱水率的变化关系三维响应曲面Fig.1 Three-dimensional response surface plot of dewatering efficiency,temperature and pH

污泥中的水分主要包括胞内水和EPS结合水,细胞壁中磷脂的正磷酸盐键易在碱性、高温条件下被破坏[17],细胞壁的分解加速,将胞内水转化为胞外水[18]。本文结果与前人研究结果一致,即热碱结合工艺的脱水率显著高于单纯热处理[19]。

2.2 污泥脱水后ARGs的变化趋势

TAP可以使污泥中的细胞破裂,将胞内物质转化为胞外物质,增加了滤液中的有机物含量。未预处理污泥的SCOD为120 mg/L,总COD为8 230 mg/L。在pH=11、温度为90 ℃条件下,污泥经过TAP后,随着反应时间的增加,SCOD大体不断上升(见图2),总COD基本保持稳定,略有下降。在反应至100 min时,SCOD已增加至3 320 mg/L,总COD为7 680 mg/L。

图2 TAP污泥SCOD与污泥破壁率、脱水率的关系Fig.2 The relationship between changes of SCOD and cracking efficiency,dewatering efficiency for sludge after TAP

污泥滤液中的SCOD可以一定程度反映污泥细胞的破壁程度。污泥在TAP反应开始至80 min内,污泥脱水率与破壁率均上升,且污泥脱水率达到最高值(41.0%),因此最优TAP工况为pH=11、温度90 ℃,反应时间80 min;反应至80～100 min,污泥脱水率下降,破壁率上升。研究表明,TAP有助于SCOD的溶解,是一种有效的污泥脱水技术[5]198-199。反应初期,在高温、强碱作用下,胞内水由于细胞壁破裂释放至胞外,该阶段脱水率与细胞破壁率呈正相关;随着细胞壁不断破裂,大量胞内有机物转化为EPS,EPS与胞外水结合,导致脱水率降低。本研究也证实过度破壁对污泥脱水效果反而不佳,高浓度EPS将会影响脱水率[20]。

图3 经过TAP后污泥中iARGs、eARGs、intI 1和16S rDNA绝对丰度分布变化Fig.3 The trend of absolute abundance of iARGs,eARGs,intI 1,and 16S rDNA in sludge after TAP

表4 ARGs和intI 1、16S rDNA的相关性分析1)Table 4 Correlation analysis between ARGs and intI 1,16S rDNA

从图4可以看出,随着污泥破壁率的不断上升,eARGs的绝对丰度先升高后降低最终趋于稳定,这可能与微生物细胞结构破坏,胞内DNA释放有关[21]7。TAP进行40 min后,eARGs绝对丰度达到最高值。污泥经过TAP后,部分iARGs转化为eARGs,将增加ARGs的水平转移风险。TAP通过破壁方式产生大量eARGs和EPS,EPS的存在一定程度上也会导致eARGs去除效率不佳[22]。

图4 eARGs绝对丰度与污泥破壁率变化趋势Fig.4 The trend of absolute abundance of eARGs and sludge cracking efficiency

3 结 论

TAP具有良好的脱水率,在最优工况下(pH=11、温度为90 ℃,反应时间为80 min),其污泥脱水率高达41.0%,显著提高了污泥脱水率。随着污泥破壁率的上升,SCOD浓度也不断增大,但污泥脱水率先升高后降低。TAP去除iARGs和胞内intI 1的同时,eARGs和胞外intI 1的绝对丰度均呈现不同程度上升。eARGs绝对丰度随着污泥破壁率升高,先升高后降低最终趋于稳定。