编码IL-7的溶瘤疱疹病毒通过激活CD8+T细胞增强对肝癌的杀伤活性

黎东明 李鹏 陆路 王学国 王太成 赵红岩

（海南医学院第二附属医院肝胆胰腺外科，海口 570100）

肝癌是恶性肿瘤之一，病死率在所有癌症中排名第二，具有高转移和高复发的特点［1-3］。虽然肝癌可以通过手术、药物或化疗进行干预，但患者的预后并不好，有数据表明，美国的肝癌五年生存率仅为18%，而中国的原发性肝癌患者五年生存率仅为12.1%［4-5］。因此，研发新的肝癌治疗手段十分必要。

溶瘤病毒是一种天然的或通过基因工程改造的病毒，可以选择性地感染肿瘤细胞并在其中大量复制，导致肿瘤细胞裂解，对正常细胞无明显毒性，是一种有前景的癌症治疗手段［6-7］。美国批准的第一款溶瘤病毒产品为Talimogene laherparepvec（TVEC），是一种工程化的单纯疱疹病毒（herpes sim-plex virus，HSV），编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）［8］。IL-7是维持T细胞稳态的关键分子，可以使初始T细胞状态得以维持，并且可以促进中央记忆T细胞亚群的生成，而分化程度低的T细胞以及中央记忆T细胞的形成有利于T细胞发挥抗肿瘤免疫反应。此外，IL-7还通过增加肿瘤反应性T细胞的数量和拮抗转化生长因子-β（TGF-β）信号通路，促进肿瘤内抗肿瘤免疫状态的重建［9］。

本研究为了最大化IL-7的局部有效剂量并获得协同治疗效果，试图构建一种新型的工程化溶瘤病毒，其以HSV为主体结构，同时编码IL-7，从而检测这种工程化溶瘤病毒是否可以发挥对肝癌的协同抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠及细胞系 15只5周龄BALB/c小鼠购自海南药物研究所有限责任公司，饲养于海南医学院实验动物中心的SPF动物房，所有小鼠自由进食饮水。本实验经海南医学院第二附属医院伦理委员会审批（20210625169）。小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10、结直肠癌细胞系CT-26以及肝癌细胞系H22购自中科院上海细胞库，所有细胞在37 ℃、5%CO2条件下培养于添加10%胎牛血清的DMEM培养基。

1.1.2 主要试剂 胶原酶Ⅰ、RIPA试剂、PMSF、结晶紫溶液、BCA蛋白定量试剂盒以及ECL发光液购自上海碧云天生物科技有限公司；4%多聚甲醛、苏木精以及DAB试剂购自上海翌圣生物科技有限公司；小鼠抗IL-7及小鼠抗CD8抗体购自美国Abcam公司；小鼠IL-7 ELISA试剂盒、小鼠抗GAPDH以及山羊抗鼠二抗购自杭州联合生物科技有限公司；PE标记的鼠抗CD8抗体及APC标记的鼠抗Granzyme B抗体购自美国Biolegend公司；Fix/Perm溶液及Perm/Wash 溶液购自美国BD Biosciences。

1.2 方法

1.2.1 溶瘤病毒HSV-IL-7的构建 HSV基因源于HG52毒株，通过特异性消除HG52基因组中ICP34.5以及ICP47得到HSV的基因组序列。HSVIL-7由HSV衍生而来。将包含CMV启动子的IL-7基因序列插入ICP34.5的基因座位点，获得HSV-IL-7的基因组序列。将HSV或HSV-IL-7病毒质粒转染Vero细胞，在显微镜下检测6轮空斑筛选纯化，得到HSV或HSV-IL-7病毒颗粒。再将获得的病毒颗粒继续感染Vero细胞，在其中扩增，滴定，分成等份后在-80 ℃冰箱中保存备使用。

1.2.2 Western blot检测溶瘤病毒感染后IL-7表达 分别取3×105个B16-F10、CT-26以及H22细胞置于6孔板中，待密度达到70%时以MOI=5加入HSV或HSV-IL-7，18 h后使用RIPA裂解细胞，12 000 g离心20 min后收集上清，按照试剂盒说明进行BCA蛋白定量，之后使用12%SDS-PAGE进行电泳，转膜，使用5%脱脂奶粉，室温2 h的封闭，使用小鼠抗IL-7（1∶1 000）及小鼠抗GAPDH抗体（1∶1 000）对PVDF膜进行4 ℃过夜孵育，次日使用山羊抗鼠的二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，使用ECL发光液后在成像仪中对蛋白条带进行显影。

1.2.3 结晶紫染色法检测溶瘤病毒对肿瘤细胞的裂解作用 分别取1×104个B16-F10、CT-26以及H22细胞置于96孔板中，待密度达到70%时以对应的MOI加入HSV或HSV-IL-7，72 h后除去培养基，每孔中加入50 μl结晶紫溶液，孵育5 min。孵育结束后使用双蒸水对孔板清洗5次，使用扫描仪对孔板进行成像。

1.2.4 小鼠移植瘤模型验证HSV-IL-7的肿瘤抑制活性 15只5周龄BALB/c小鼠背部皮下注射3×105个H22肿瘤细胞，待肿瘤长至100 mm3时，将小鼠随机分为3组，分别在瘤内注射PBS，3×106PFUs HSV以及3×106PFUs HSV-IL-7进行治疗。3 d后重复给药1次。治疗之后每2 d测量1次肿瘤体积和体重，肿瘤体积计算公式：体积=长×宽2/2。此外，密切监测小鼠存活情况，并绘制生存曲线。

1.2.5 ELISA检测血清及肿瘤组织中IL-7、IFN-γ及TNF-α含量 在小鼠治疗后的第7天，通过眼眶采血获得100 μl抗凝血，静置离心后获得血清，按照制造商的方案使用小鼠IL-7 ELISA检测试剂盒检测血清中IL-7含量。此外，在小鼠死亡后，取肿瘤组织50 mg，加入200 μl PBS进行匀浆，离心后取上清，按照制造商的方案使用小鼠IL-7、IFN-γ及TNF-α ELISA检测试剂盒检测肿瘤组织中IL-7、IFN-γ及TNF-α含量。

1.2.6 免疫组化法检测肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润情况 在小鼠死亡后，取肿瘤组织100 mg，使用4%多聚甲醛进行固定，之后经过脱水、包埋、切片，制成组织切片。组织切片经过抗原修复后，用5%山羊血清室温封闭2 h，之后滴加50 μl抗CD8抗体（1∶100），4 ℃孵育过夜，次日使用山羊抗鼠二抗（1∶1 000）室温孵育1 h，滴加DAB溶液显色，苏木精溶液复染后进行封片，显微镜下观察并拍照。阳性细胞数目使用Image Pro Plus 6.0进行计数。

1.2.7 流式细胞术检测肿瘤浸润CD8+T细胞Granzyme B的分泌水平 在小鼠死亡后，取肿瘤组织50 mg，切成直径为1～2 mm的碎片后，使用胶原酶在37 ℃下消化1 h，使用100 μm细胞筛进行过滤后，离心收集细胞，加入5 μl PE标记的鼠抗CD8抗体室温避光孵育20 min，使用PBS清洗3次后加入Fix/Perm溶液以及5 μl APC标记的鼠抗Granzyme B抗体，室温避光孵育20 min后，使用perm/wash buffer清洗3次后，在流式细胞仪上进行检测，数据使用Flowjo V10进行分析。

1.3 统计学分析 所有实验数据采用SPSS19.0进行统计学处理。计量数据采用表示，组间样本比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSV-IL-7感染肿瘤细胞后表达IL-7 HSV以及HSV-IL-7结构如图1A。将HSV、HSV-IL-7分别感染不同的肿瘤细胞后，Western blot检测结果显示，HSV感染的肿瘤细胞中无IL-7表达，相反，HSVIL-7感染的肿瘤细胞显著高表达IL-7（图1B）。

图1 HSV和HSV-IL-7的特征Fig.1 Characteristic of HSV and HSV-IL-7

2.2 HSV及HSV-IL-7对肿瘤细胞的体外裂解情况 在不同的肿瘤细胞感染HSV及HSV-IL-7后，结晶紫染色结果显示，HSV及HSV-IL-7均能对不同的肿瘤细胞产生裂解效应，且裂解能力随着MOI的增大而逐渐增强。MOI＞5时，HSV及HSV-IL-7几乎可以裂解绝大多数的肿瘤细胞（图2）。

图2 结晶紫染色检测HSV和HSV-IL-7在不同肿瘤细胞中的溶瘤情况Fig.2 Oncolysis of HSV and HSV-IL-7 in different tumor cells were detected by crystal violet staining

2.3 HSV-IL-7抑制肝癌细胞H22的体内生长 在小鼠的皮下移植瘤模型中检测HSV-IL-7对肿瘤的抑制情况，肿瘤体积结果显示，尽管HSV治疗组有肿瘤抑制的趋势，但与PBS组相比差异无统计学意义（P＞0.05），而HSV-IL-7治疗组的肿瘤生长被显著抑制（P＜0.01，图3A）。小鼠的生存期结果显示，HSV治疗组与PBS组相比小鼠的存活时间被延长，而HSV-IL-7治疗组与HSV治疗组相比生存期进一步延长（P＜0.01，图3B）。此外，三组小鼠的体质量差异无统计学意义（P＞0.05，图3C）。

图3 HSV和HSV-IL-7的体内抗肿瘤活性Fig.3 Anti-tumor activity of HSV and HSV-IL-7 in vivo

2.4 HSV-IL-7增强体内IL-7的分泌水平以及CD8+T细胞的浸润能力 血清ELISA结果显示，HSV与HSV-IL-7治疗组的小鼠血清IL-7含量差异无统计学意义（P＞0.05），HSV-IL-7治疗组与PBS组比较，血清IL-7含量有一定升高（P＜0.05，图4A）。同时，瘤内ELISA结果表明，HSV-IL-7治疗组瘤内IL-7含量显著高于PBS组和HSV治疗组（P＜0.000 1，图4B）。免疫组化结果表明，HSV-IL-7治疗组的肿瘤浸润CD8+T细胞的数目显著高于PBS组（P＜0.001）和HSV治疗组（P＜0.05，图4C）。

图4 IL-7含量及CD8+T细胞检测Fig.4 IL-7 content and CD8+T cells detection

2.5 HSV-IL-7增强肿瘤浸润CD8+T细胞Granzyme B表达以及效应细胞因子含量 流式细胞术结果显示，HSV治疗后分泌Granzyme B的CD8+T细胞数目升高，与此同时，HSV-IL-7治疗组分泌Granzyme B的CD8+T细胞数目较HSV治疗组进一步增加（P＜0.01，图5A、B）。此外，肿瘤组织中效应细胞因子IFN-γ及TNF-α表达在HSV和HSV-IL-7治疗后均升高，而HSV-IL-7治疗组的IFN-γ及TNF-α表达较HSV治疗组更高（P＜0.000 1，图5C、D）。

图5 Granzyme B在肿瘤浸润CD8+T细胞中表达及肿瘤组织中细胞因子的含量Fig.5 Granzyme B expression in tumor infiltration CD8+T cells and cytokines in tumor tissues

3 讨论

癌症免疫疗法已在肿瘤治疗中占据越来越重要的地位［10］。“热”肿瘤对免疫疗法更敏感［11］。然而，大多数实体瘤被鉴定为“冷”肿瘤［12］。因此，提高肿瘤微环境中T细胞浸润是提高癌症免疫治疗疗效的关键举措。溶瘤病毒可以像传统的癌症治疗方法一样直接杀死肿瘤细胞［13］。其作用机制为病毒特异性感染肿瘤细胞，经过大量复制后裂解肿瘤细胞［14］。本研究选择经过改造的HSV作为溶瘤病毒，在体外证明了这种溶瘤病毒可以对多种肿瘤细胞产生剂量依赖的裂解作用［15］。

溶瘤病毒对肿瘤细胞杀伤后进一步提供了肿瘤相关抗原并刺激炎症因子释放，以触发先天和适应性抗肿瘤免疫［16］。这种抗肿瘤免疫反应导致包括T淋巴细胞在内的多种免疫细胞向肿瘤微环境浸润［17］。除了溶瘤病毒本身的抗肿瘤活性外，当这些病毒携带了细胞因子、趋化因子和共刺激分子等基因以增强抗肿瘤免疫时，可以发挥超出其溶瘤性质的抗肿瘤反应［18-19］。

IL-7在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。IL-7通过IL-7R信号通路在T细胞存活、活化、增殖以及记忆T细胞形成中发挥重要作用［20-21］。此外还有研究表明，IL-7可以显著增加肿瘤浸润的CD8+T细胞，增强CD8+T细胞的抗肿瘤作用，逆转肿瘤组织中的免疫抑制作用［22］。在本研究中，经过HSV-IL-7治疗的小鼠肿瘤中浸润的CD8+T细胞数量显著增多，同时CD8+T细胞分泌Granzyme B的能力也显著增强，表明其效应功能较强，与先前研究中IL-7对T细胞的影响基本吻合。

在本研究中，尽管HSV以及HSV-IL-7在体外均具有良好的溶瘤活性，但在小鼠移植瘤模型中，虽然HSV治疗组较PBS组小鼠在生存期方面有显著延长，但HSV对肿瘤的抑制能力不明显。究其原因，可能是由于HSV的肿瘤靶向性较弱，导致富集在肿瘤区域的病毒量较少，造成轻微的炎症反应。相反，表达IL-7的溶瘤病毒除了本身具备的溶瘤效应之外，其分泌的IL-7具有全局效应，激活了机体自身的抗肿瘤免疫反应，从而显著抑制肿瘤生长，并进一步延长小鼠的生存期。

在任何基于细胞因子的免疫治疗中，与细胞因子释放综合征相关的毒性都应严格控制［23-25］。本研究中使用的HSV-IL-7溶瘤病毒的细胞因子分泌水平受多重因素的影响，如病毒在细胞中的复制效率，感染的靶细胞种类等。本研究通过监测小鼠的体质量变化，发现HSV-IL-7与其他治疗组无显著差异，一定程度说明这种疗法未产生严重的细胞因子释放毒性。后续的研究有必要进一步对IL-7的分泌水平进行深入探究。除此以外，HSV-IL-7在理论上可以将IL-7的释放限制在肿瘤部位，研究也表明，HSV-IL-7治疗组的肿瘤组织中IL-7含量显著高于其他组别，而外周血中IL-7水平则轻微升高。这也避免了系统性的细胞因子分泌造成的全身毒性［26］。

综上所述，HSV-IL-7在体内外均具有良好的肿瘤抑制活性，同时其可以通过分泌IL-7激活体内CD8+T细胞的抗肿瘤性，从而进一步抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的生存期。本研究为进一步开展HSV-IL-7治疗肝癌的临床研究奠定了坚实基础。