锌指蛋白ZNF23在非小细胞肺癌中表达的研究

曲 微,任洪久,徐艺桐,邱雪杉*,赵俊军*

(1.大连理工大学附属中心医院 病理科,辽宁 大连116000;2.中国医科大学附属第一医院 病理科,辽宁 沈阳110000)

近年来,肺癌已经成为全球癌症死亡的首要原因。我国的肺癌发生率也在快速增长,死亡率已经攀升至第一位[1-2]。多于百分之八十的肺癌被确诊为非小细胞肺癌。虽然目前的治疗方法有了很大的进步,但仍然没有控制肺癌发生的有效方法[3]。转录抑制因子在预防肺癌发生发展中发挥必不可少的作用。因此寻找有效的抑癌生物标记物,探索新的治疗靶点是非常必要的。

含有Krab(Kruppel associated box)结构域的锌指蛋白-KRAB-ZFPs是人类转录抑制蛋白家族中数量最多的一类蛋白。它们参与很多重要的生理过程,包括细胞发育,增殖和凋亡的调控。ZNF23是近年发现的Krab结构锌指蛋白家族的一员。ZNF23基因位于染色体16q22[4-5],这一区域含有多种抑癌基因并在肿瘤发生时有突变,例如卵巢癌和子宫内膜癌[6-7]。它含有N端Krab结构域及C端C2H2锌指结构[8]。其中Krab结构域被认为是一个保守的模体并含有75个氨基酸,分为A盒和B盒,可以通过募集其他蛋白发挥转录抑制功能,例如KAP-1[9-10]。Krab结构域中均含有A盒,起到主要的抑制功能,B盒并非存在于所有,对A盒发挥辅助功能[11]。KRAB-ZFPs的Krab 结构域是高度保守的,有着相同的氨基酸序列,因此推测ZNF23与其它KRAB-ZFPs可能有相同的分子靶点[12]。锌指模体可能参与DNA的识别[13]。

ZNF23蛋白在人类各种组织中广泛表达。但在人类肿瘤中报道较少。最近几年越来越多的研究发现ZNF23参与多种恶性肿瘤的发生发展进程,有研究证实ZNF23在人类卵巢癌和子宫内膜癌中表达明显降低,并且是p53非依赖性的[14]。还有研究检测了在肝细胞癌中癌与癌旁组织的ZNF23的mRNA水平及其与临床预后关系,结果显示ZNF23的mRNA水平癌旁明显高于癌组织,还能抑制肝细胞周期,促进调亡[15]。然而ZNF23在非小细胞肺癌中的表达情况,以及其对癌细胞作用的机制,这些研究未见报道。为了明确这些问题,我们检测了非小细胞肺癌组织中ZNF23蛋白和mRNA的表达,并研究了ZNF23调节细胞周期进展的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1组织标本 151例组织标本全部来自中国医科大学附属第一医院病理科。患者手术前均没有接受过任何化疗或放射治疗。标本用中性福尔马林固定,石蜡包埋,常规进行HE染色,分别由两位病理医师,根据WHO(2004)肺癌分类标准和IUAC(2002)TNM分期标准确定肿瘤的组织学分型以及临床病理分期。151例NSCLC包括:鳞癌75例,腺癌76例;高中分化97例,低分化54例;临床病理分期显示I期82例,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ期共69例;淋巴结转移66例,无淋巴结转移85例。18对新鲜的非小细胞肺癌和癌旁正常肺组织(远离原发灶)低温快速冷冻,以后用于RNA。患者病理参数有组织学类型、分化程度、病理分期、肿瘤大小和淋巴结转移等。

1.1.2细胞系和细胞培养 A549、H460和H1299细胞系购自于American Type Culture Collection (Manassas,VA,USA)。LH7、SPC、LTE和LK2细胞系购与中国科学院上海细胞库。冻存于液氮的A549、H1299、H460和HBE等细胞经复苏后细胞使用RPMI 1640和高糖DMEM培养基含10%的灭活小牛血清,以及100 IU/ml青霉素和100 μg/ml链霉素。37℃、5%CO2的条件下培养,每两天换一次液,并用0.25%的胰酶进行消化传代。

1.2 方法

1.2.1免疫组织化学 将组织蜡块切成4 μm厚切片,进行脱蜡,脱水,修复等步骤后采用Elivision法进行免疫组织化学染色。染色步骤简述如下:柠檬酸缓冲液(pH=7.0),高温高压进行抗原修复;3%H2O2和5%血清37℃下分别孵育切片30 min;一抗(antiZNF23 1∶50稀释)4℃孵育过夜;反应放大剂和IgG聚合物37℃分别孵育组织切片35 min;然后使用DAB试剂进行显色,苏木素复染细胞核8 min。所有切片由两位经验丰富的病理医师在不知道参数的情况下观察切片和细胞计数。ZNF23蛋白定位于胞核。规定0%～25%的胞核染色记为1分,26%～50%记为2分,51%～75%记为3分,76%～100%记为4分。同时根据染色强度:无染色或淡染色记为0分,黄色颗粒记为1分,棕褐色颗粒记为2分。ZNF23的得分实为着色细胞得分乘以着色强度得分。我们将总分<4分判定为ZNF23阴性,总分≥4分判定为ZNF23阳性

1.2.2细胞培养 H1299细胞使用RPMI 1640培养基培养,A549细胞使用高糖DMEM培养基培养,培养基内含10%的灭活小牛血清,以及100 IU/ml青霉素和100 μg/ml链霉素。37℃、5%CO2的条件下培养,每两天换一次液,并用0.25%的胰酶进行传代。

1.2.3干扰siRNA转染 转染前一天将细胞按40%～60%密度分散种于6孔板,使用LipofectamineTM 2000作为转染试剂进行转染,48 h后提取细胞,用于后续实验。Real-time PCR和Western blot检测干扰效率。ZNF23干扰序列和阴性对照均购自上海吉玛生物公司。

1.2.4Western blot分析 收集的细胞用NP-40(含1 mM PMSF和磷酸酶抑制剂)裂解液裂解40 min,超声粉碎后冰浴中静置15 min。低温高速离心(4℃,12 000 rpm)15 min,取上清。样品置于100℃水浴中煮5 min。向泳道内加入18 μl样品(含60 μg蛋白)及蛋白Marker。10%SDS-PAGE电泳分离蛋白后转印至PVDF膜(40～100V,2h)。5%脱脂奶粉或5%BSA室温封闭2hr,以TTBS洗涤1次,每次5 min。分别加入一抗4℃孵育过夜。TTBS洗涤3次,每次10 min。加辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2000)室温孵育2 h。TTBS洗涤3次,每次10 min。采用ECL发光显色,结果经自动电泳凝胶成像分析仪(UVP Inc.,Upland,CA,USA)采集.进行灰度测定。

1.2.5细胞提取总RNA 处理后的细胞使用Trizol试剂提取总RNA,用Real-time PCR检测ZNF23等指标的mRNA表达量。六孔板每孔加入1 ml Trizol试剂静置10 min,吹打并移入1.5 ml EP管中。每1 ml Trizol加入200 μl氯仿,上下震荡,室温静置10 min。4℃ 12 000 rpm离心15 min,取上层无色水相。在水相中加入等体积的异丙醇,震荡混匀,室温静置10 min。4℃ 12 000 rpm离心15 min,可见RNA沉于管底,弃上清。分别加入1 ml 75%和100%无水乙醇,温和震荡,悬浮沉淀。4℃ 7 500 rpm离心10 min,可见RNA沉于管底,弃上清。用DEPC水溶解RNA并测定RNA A260/A280,比值在1.8～2.0之间纯度为佳。

1.2.6Real-time PCR 利用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)合成特异性的cDNA,设计引物序列(表1)反应体系10 μl(总RNA 5 μl),在基因扩增仪内进行如下反转步骤: 37℃,15 min; 85℃,5 s,4℃ 保存,待第二天进行PCR,或-20℃长期保存,一个月内使用。Real time PCR 在Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems,USA)内完成。反应体系20 μL,包括cDNA 1.33 μL,按照TaqMan MicroRNA Assays Kit(Applied Biosystems)优化程序进行扩增,采用相对定量的方法,循环过程如下:一次循环:95℃,30 s;: 95℃,5 s;60℃,30 s,40个循环。实验及对照组均设3个副孔。实验结束后读取RQ值并进行统计分析。

表1 引物序列

1.2.7细胞周期试验 6孔板干扰48 h后,当细胞长满却不拥挤时胰酶消化,吸管吹打至1.5 ml EP管,4℃ 1 200 rpm离心8 min,倒掉上清液留下沉淀,加入1 ml PBS洗一遍,4℃ 1 200 rpm离心8 min,倒掉上清,加入70%乙醇使细胞悬浮-20℃过夜以固定细胞。第二天取出,4℃ 1 200 rpm离心8 min,倒掉乙醇,PBS洗一遍,4℃ 1 200 rpm离心8 min,倒掉PBS,每管加入400 μL PI染料(碧云天公司),4℃ 静置30 min,流式细胞仪进行检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0统计分析软件,对ZNF23表达和临床病理因素的关系用卡方检验;其他实验结果采用t检验进行数据分析,用mean±SD表示,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZNF23在非小细胞肺癌组织内的表达情况

我们对151例非小细胞肺癌切片使用免疫组织化学方法进行ZNF抗体染色,并选择癌旁正常支气管上皮作为对照。结果显示ZNF23蛋白定位于细胞核,且在正常肺支气管上皮细胞中强染色,非小细胞癌组织中低表达(图1A-H),并且低分化肿瘤组织的染色明显低于高分化肿瘤。我们还分析了ZNF23的表达情况与临床的相关性,发现ZNF23在肺癌组织中的表达与年龄(P=0.223)和性别(P=0.336)无明显相关性,却和组织类型(P=0.000),分化程度(P=0.000),TNM分期(P=0.03),肿瘤大小(P=0.018)和淋巴结转移(P=0.03)相关(表2)。ZNF23在肺腺癌与鳞状细胞癌中表达均明显降低,并肿瘤分化程度正相关,与TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移数量负相关。我们还对18对新鲜的非小细胞肺癌的癌和癌旁组织进行real-time PCR检测了ZNF23的mRNA表达水平,其中有13对的癌组织样本ZNF23的mRNA表达明显低于癌旁组织,5对的癌组织样本与癌旁组织的ZNF23表达水平相近,差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。以上结果表明非小细胞肺癌患者的ZNF23蛋白水平低于癌旁正常组织,作为肺非小细胞癌的抑癌因子。

图1 ZNF23在非小细胞肺癌组织中的蛋白表达情况

图2 18对新鲜肺癌与癌旁正常组织realtime PCR结果统计

表2 ZNF23在非小细胞肺癌组织中的表达和临床因素相关性统计

2.2 ZNF23在非小细胞肺癌细胞系中的表达和干扰情况

我们采用Western Blot方法检测了10种肺癌细胞系A549、LTE、SPC、H1299、H157、83a、LK2、LH7和H460中的内源性ZNF23的蛋白含量,其中A549、LTES和H1299细胞系ZNF23蛋白高表达,LK2和H460细胞系中ZNF23蛋白低表达。最终选取高表达ZNF23蛋白的细胞系A549和H1299进一步研究(图3A)。在选取的细胞系A549和H1299中进行干扰实验,同时转染ZNF23siRNA及对照siRNA,并应用Weatern Blot、Real-time PCR方法分别在蛋白水平及mRNA水平检测了干扰效率,结果显示干扰组内源性ZNF23后其蛋白及mRNA水平表达较对照组均显著减少(图3B、C),证实干扰效率已经达到标准,并进行下一步细胞周期实验。

图3 ZNF23在肺癌细胞系中的表达及干扰效率测定

2.3 ZNF23抑制细胞周期进展

在干扰效率达到的前提下,我们采用PI染料对干扰组和对照组细胞进行染色,用酶标仪检测两组细胞周期进展并进行比较。结果显示ZNF23干扰组细胞周期进展更快,多在S/G2期,而对照组的细胞周期多停滞在G1期(图4)。以上结果表明ZNF23通过阻滞细胞周期进展而抑制细胞增殖,从而发挥肿瘤抑制作用。

图4 ZNF23干扰组与对照组细胞周期对比

3 讨论

含有Krab结构域的锌指蛋白(Krupple-associated box-containing zinc-finger proteins) KRAB-ZFPs是人类转录抑制蛋白家族中最数量最多的一类。它所含有的Krab结构域,参与很多重要的生理过程,包括细胞发育,增殖和凋亡等。ZNF23是一种Krab结构锌指蛋白。它的基因所在染色体区有含有多种肿瘤抑制基因,并在肿瘤发生时突变[6-7]。ZNF23在人类肿瘤中的报道相对很少。已经有研究证实ZNF23在人类卵巢癌和子宫内膜癌中表达减少[14]。SHI等[15]也发现在肝癌中ZNF23的mRNA水平癌旁明显高于癌组织,并且和TNM分期相关,还能抑制肝细胞周期,促进调亡。还有学者证实ZNF23通过线粒体依赖途径抑制皮肤恶性黑色素瘤的恶性生物学行为,并发现ZNF23诱导凋亡是通过激活caspase-3、P27、P53并抑制Bcl-2的表达[16]。但ZNF23在非小细胞肺癌中的表达及其与临床因素的关系还尚未有人研究。我们的研究发现ZNF23的蛋白和mRNA表达水平在肺癌组织中均低于癌旁正常组织,而且和TNM分期,肿瘤大小,淋巴结转移,分化程度及组织类型都密切相关。这些都与先前的研究相一致。这些结果都说明ZNF23在非小细胞肺癌的发生发展中起到不可忽视的作用。

为了探究ZNF23在非小细胞肺癌发展中的作用机制,我们首先在多种肺癌细胞系中检测了蛋白表达水平,并选择了ZNF23蛋白水平较高的A549和H1299细胞系做进一步的研究。我们用siRNA干扰ZNF23的蛋白表达,并发现与对照组相比,两种细胞系干扰组的细胞周期进展更快,细胞多在S/G2期。这个结果说明ZNF23可以通过抑制细胞周期进展来发挥抑制细胞增殖作用,而ZNF23对肺癌细胞侵袭、凋亡的作用以及其深入的机制及信号通路还不清楚,需要进一步研究。

KRAB-ZFPs的Krab 结构域是高度保守的,有着相同的氨基酸序列,而ZNF23是含有Krab锌指蛋白家族中重要的一员,因此推测ZNF23与其它KRAB-ZFPs可能有相同的分子靶点[12]。HUANG等[14]研究证实ZNF23在人类卵巢癌和子宫内膜癌A.ZNF23在多种肺癌细胞系中的内源性表达。B.Western bolt检测A549和H1299细胞中ZNF23干扰效率。C.realtiime PCR检测A549和H1299细胞中ZNF23干扰效率。

中表达明显降低,并且通过上调p27的表达抑制细胞周期进展,并且是p53非依赖性的。p27是细胞周期蛋白CDK抑制蛋白(CDKI)的其中一种[17],体外实验证实它是通过抑制G1期激酶复合物如细胞周期蛋白E-CDK2和D-CDK4等,使细胞停滞在G1期[18]。体内实验也发现p27蛋白水平升高使细胞周期多停滞在G1期,细胞增殖也随即停止[19-20]。有研究者发现cAMP处理过的巨噬细胞,其内p27的合成量增加了几倍,细胞也停止在G1期[21]。此外,PENG等研究发现在用抗上皮生长因子受体处理的细胞中,p27的mRNA表达水平升高,进而其蛋白合成增加并抑制CDK2的活性[20],说明在抗增殖信号的控制下,p27的迅速增多对于负调控细胞增殖并使其停滞于G1期是一个重要环节。因此我们有理由推测ZNF23在非小细胞肺癌中抑制细胞周期进展是通过上调p27进行的,为今后的研究提供了思路。

随着对肿瘤研究的深入发展,越来越多的研究表明microRNA在肿瘤的发生发展中起到重要作用,最新研究证实microRNA-1246在顺铂耐药卵巢癌中高表达,并且通过抑制ZNF23的转录调控细胞周期及凋亡[22]。Wei等人研究发现在分泌期子宫内膜上皮中细胞核小分子RNA SNORA5与micro146a-3p/ZNF23信号通路促进子宫内膜的容受性[23]。这些研究都表明ZNF23可作为多种microRNA的靶点调控细胞周期与凋亡,成为肿瘤治疗的潜在新靶点。