葛根种质资源遗传多样性分析及分子身份证构建

何 文,蔡兆琴,陈会鲜,张秀芬,黄珍玲,郭素云,阮丽霞,莫周美

(农业农村部龙州热带作物科学观测综合实验站/广西南亚热带农业科学研究所,广西 龙州 532415)

【研究意义】葛根(PuerariaDC.)为豆科葛属多年生植物,以其干燥根入药[1],享有“北参南葛”的称号[2],具有生津止渴、护肝、美容丰胸等功效[3-5]。除用于生产药品、制作成食品外,葛根还能作为饲料[6]和乙醇生产原料[7],具有极大的开发前景。我国是葛根的起源分布中心,但因葛根资源开采过度和保护不及时,导致一些拥有优良性状的葛根资源逐渐丢失[8],因此研究葛根种质资源多样性,构建其分子身份证,对葛根种质资源区分和精准鉴定具有重要意义。【前人研究进展】遗传多样性代表了生物种群内部和种群之间的可遗传变异,是生物多样性的重要组成部分和基础[9]。种质资源的遗传多样性通常采用表型性状和分子标记进行研究[10]。近年来葛根种质多样性研究主要集中于SRAP[11]、RAPD[12-14]、SCoT[15]、SSR[16]等分子标记,而葛根遗传性状多样性方面的研究较少[17]。ISSR(Inter-simple sequence repeat)简单序列重复区间扩增多态性分子标记具有操作简单、可重复、引物通用性高等优点,被视为理想的遗传标记方法,广泛应用于椰子[18]、甘蔗[19]、赤苍藤[20]等作物进行遗传多样性分析[21]。葛花[22]和袁灿等[23]研究表明利用遗传性状和ISSR分子标记研究葛根遗传多样性具有可行性,但研究中选取的遗传性状内容较少,因此有必要选取更多代表性遗传性状进行研究。分子身份证(Molecular ID)是在DNA指纹图谱的基础上提出的一种鉴定种质资源的方法,即将指纹图谱进行编码赋值,使每一份种质拥有一段特定的字符串,通过字符串对种质进行区分[24],目前已对棉花[25]、茶树[26]、金针菇[27]等作物构建了分子身份证。【本研究切入点】基于遗传性状和ISSR分子标记的葛根遗传多样性研究较少,且未构建葛根DNA分子身份证。【拟解决的关键问题】本研究拟通过25个遗传性状和ISSR分子标记对葛根遗传多样性进行研究,构建葛根DNA分子身份证,为更深入全面地研究葛根种质资源多样性和葛根品种鉴别提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究使用的试验材料共计21份葛根种质资源 (表1),于2018—2019年收集自广西、安徽、浙江和江西,种植于广西南亚热带农业科学研究所葛根种质资源圃。ISSR引物来源于加拿大哥伦比亚大学UBC公司公布的100条引物(http：//www.biotech.ubc.ca/services/naps/ primers.html.)中的48条,由北京擎科生物科技有限公司合成[20],DL2000 DNA Marker、2×EsTaqMasterMix、6×Glycerol DNA Loading Buffer、Biospin全能型植物基因组DNA提取试剂盒等试剂购于南宁国拓生物科技有限公司,其他生化试剂及引物均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 供试葛根材料及来源

表2 葛根性状及其赋值

1.2 试验方法

试供材料于2020—2021年每年4月采用扦插苗统一种植于广西南亚热带农业科学研究所葛根种植基地,每份材料种植40株,株行距为1.5 m×0.5 m,田间管理按照常规方法。

1.2.1 遗传性状 在葛根生长中期参照表2对完全展开叶片颜色、主茎颜色、嫩茎颜色、嫩茎茸毛颜色等16个质量性状进行调查和赋值;在收获期测定葛根主茎粗、主茎节密度、块根长度、块根宽度、单株鲜重、块根干物率、总黄酮含量、葛根素含量和淀粉含量。

1.2.2 DNA提取与检测 本试验于2021年7月取各种质5～8片无病虫害顶端嫩叶,放入已编号的自封袋后放置于冰盒,带回实验室于-40 ℃保存备用。混合取样,用液氮研磨后使用Biospin全能型植物基因组DNA提取试剂盒提取葛根全基因组DNA,取3 μL提取的DNA通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其质量,用超微量紫外分光光度计(Thermo NanoDrop one)检测DNA浓度和纯度,检测完毕后将合格的DNA稀释至合适浓度进行PCR扩增反应,剩余DNA在-20 ℃冰箱冷冻保存。

1.2.3 PCR扩增与引物筛选 以表型差异较大的4个葛根样本DNA为模板,从48条ISSR引物中筛选出10条扩增效果好、背景清晰、多态性丰富的引物进行后续PCR扩增(表3)。PCR扩增体系(25.0 μL)：DNA模板2.0 μL,10×Bufer 2.5 μL,Primer-F(0.3 μmol/L) 0.6 μL, Primer-R(0.3 μmol/L) 0.6 μL,4dNTPs(0.25 μmol/L)2.0 μL,MgCl(1.5 mmol/L)2.0 μL,TaqDNA聚合酶(5 μmol/L)0.3 μL,加ddH2O补足至25.0 μL。PCR程序：94 ℃ 预变性5 min,进行35个循环：94 ℃变性45 s,55～62 ℃复性45 s,72 ℃延伸1.5 min;最后72 ℃延伸10 min,于4 ℃保存。将PCR产物以2.0%琼脂糖凝胶(电压120 V电泳50 min)进行检测。使用凝胶成像系统拍照并保存结果(图1)。

1.3 数据处理

对21份葛根种质资源描述性遗传性状数据化(表2),使用Excel 2019和SPSS 20.0软件进行遗传性状变异系数、Shannon-Weaver多样性指数计算和Ward法聚类分析。

表3 10对ISSR引物信息

图1 引物P17在供试材料中的扩增结果Fig.1 Amplification results of primer P17 in experimental materials

Shanno-Weaver多样性指数计算公式：

H′=-ΣPi×lnPi

其中Pi为某性状第i级别内材料份数占总份数的百分比,ln为自然对数。

根据PCR扩增产物电泳在凝胶某个相同迁移率位置上有DNA条带记为1,无DNA条带记为0制作ISSR数据矩阵,利用Popgene 1.32计算等位基因数(Observed number of alleles,Na)、有效等位基因数(Effective number of alleles,Ne)、Shannon’s信息指数(Shannon’s information index,I)、Nei’s基因多样性指数(Nei’s gene diversity,H′),并按照公式PIC=1-∑Pi2计算多态性信息含量(Polymorphism information content,PIC),其中Pi为当前引物第i个等位基因出现的频率,用NTsys 2.10 e软件进行非加权UPGMA聚类分析。利用3对核心引物对各个种质中条带数据按顺序进行串联排列作为分子指纹图谱,将种质资源信息和分子指纹图谱相结合,再分别利用条码生成器(https：//qr-batch.com/barcode.php)和二维码生成器(https：//cli.im/)构建21个葛根种质的分子身份证。

2 结果与分析

2.1 葛根种质资源遗传性状多样性分析

2.1.1 变异和遗传多样性分析 如表4所示,葛根种质资源遗传性状的变异系数为16.330%～55.714%,平均变异系数为35.157%,其中成熟叶片花纹变异系数最大,为55.714%,其次为顶生小叶裂缺、主茎颜色、顶生小叶形状、淀粉含量、块根宽、块根长,变异系数最小的是成熟叶片茸毛颜色,为16.330%。Shannon-Weaver多样性指数为0.381～1.844,平均值为1.166,其中主茎粗Shannon-Weaver多样性指数最大,为1.844,其次为单株鲜重、顶生小叶叶长、顶生小叶叶宽、块根长度、主茎节数密度、淀粉含量。由此可知,21份葛根种质资源在各性状上表现出不同程度的遗传多样性。

表4 21份葛根种质资源遗传性状的变异系数及遗传多样性分析

2.1.2 葛根种质资源聚类分析 采用Ward法对葛根种质资源进行聚类分析,由图2可知,遗传距离为15时,21份供试材料可以分为3类,第I类包含6份材料,对比性状数据发现第I类材料顶生小叶深裂缺,顶生小叶长宽小、主茎节数密度大、块根短粗,葛根素含量低,且可以自然开花。第II类包含4份材料,表现为主茎粗,单株产量高,块根粗,淀粉含量高。第III类包含11份材料,表现为主茎细,单株产量低,块根细长。

2.2 ISSR多样性分析

2.2.1 ISSR标记多态性分析 利用筛选出来的10条ISSR引物从21份葛根种质资源中扩增出77条条带(表5),其中多态性条带62条,平均多态性比率为80.52%;每条引物扩增的条带数为5～10条,平均7.7条,多态性条带数为2～10条,平均每条引物可扩增出6.2条多态性条带,多态性比率为40.00%～100.00%;PIC、Na、Ne、H′、I分别为0.7043～0.8468、1.4000～2.0000、1.1135～1.4741、0.0776～0.2999、0.1276～0.4720,其平均值分别为0.7800、1.7830、1.3514、0.2160、0.3353。说明筛选出的10条ISSR引物对供试材料的多态性检测效率较高,适合用于葛根种质资源的遗传多样性分析。

图2 基于21份葛根种质资源遗传性状的聚类分析Fig.2 Cluster dendrogram based on characters of 21 Pueraria DC. germplasms resources

2.2.2 遗传距离及聚类分析 用Popgene软件计算21份葛根种质资源间的遗传距离,结果表明供试材料间的遗传距离为0.035～0.541,平均为0.2442,变幅为0.506。其中广西融安的G5和江西赣州的G18亲缘关系最远,遗传距离为0.541,广西梧州的G8和G9亲缘关系最近,遗传距离为0.035。

按照遗传距离进行UPGMA聚类分析(图3)。21份葛根种质资源在遗传距离0.32时可分成3类材料(I、II、III),其中I类材料包含1份来自江西赣州的种质G18;II类材料包含来自广西融安的种质G21和安徽宜城的种质G19;III类材料包含剩余18份种质。

2.2.3 引物鉴定效率及种质特异性分析 10对ISSR引物扩增结果显示(表6),有17个葛根种质具有至少1个特有基因型,仅用1对引物便可区分开,其中G1、G2、G11和G14具有1个特有基因,G18具有9个特有基因型,G3、G7、G8和G15无特有基因型,需要不同引物条带组合才能鉴定。单对引物P17的鉴定效率最高,可区分10个葛根种质(鉴定效率47.6%),其次是P14(鉴别效率38.1%),P19(鉴定效率4.8%)仅能鉴定出G1。

表5 ISSR引物扩增结果及多态性信息

图3 基于ISSR标记的21份葛根种质 UPGMA 树状图Fig.3 UPGMA tree map of 21 Pueraria DC.germplasms based on ISSR markers

2.2.4 核心引物筛选、分子指纹图谱和分子身份证构建 10对引物在葛根种质中多态性位点的PIC值为0.7043～0.8468,表现出较高多态性,其中P17的PIC最高(0.8468),其次为P42(0.8327)和P6(0.8197)。按照ISSR标记PIC值由大到小的顺序,逐个增加ISSR引物对葛根种质进行鉴定(表7),发现最少可使用P17、P42和P6等3个ISSR引物便可实现参试种质资源的有效区分,适合选为核心引物,构建分子指纹图谱和分子身份证。

表6 单一引物对可鉴定的葛根种质

根据21份葛根种质资源在P17、P42和P6引物中的电泳数据矩阵,构建葛根种质资源分子指纹图谱(图4)。利用3对核心引物对各个种质中条带数据按顺序进行串联排列作为分子指纹图谱,将葛根种质编号、来源地和分子指纹图谱字符串等相结合,运用条码二维码生成器构建 21个葛根种质的分子身份证(表8,图5)。

表7 逐个增加ISSR引物对葛根种质的区分

1～10 表示对应ISSR标记所检测到的条带;黑色方块表示在对应位置检测到目标条带。1-10 represented the bands detected by the corresponding ISSR locus;Black squares indicated that the target band was detected at the corresponding position.图4 21份葛根种质的分子指纹图谱Fig.4 The fingerprint of 21 Pueraria DC.germplasms

表8 21份葛根种质的分子身份证信息

图5 葛根种质G11的字符串、条形码和二维码分子身份证及扫码内容示例Fig.5 String,bar code,QR code and scanning content example of Pueraria DC.germplasm G11

3 讨 论

3.1 葛根种质资源遗传多样性分析

种质资源遗传性状和分子标记是物种遗传多样性研究的常用手段[10]。本研究基于25个遗传性状和ISSR分子标记探究21份葛根种质资源多样性。通过遗传性状变异系数和多样性指数分析发现,25个遗传性状变异系数为16.330%～55.714%,低于葛花[22]研究137份葛根材料所得性状变异系数17.55%～174.04%;平均变异系数为35.157%,与袁灿等[23]的2个定量性状变幅一致。Shannon-Weaver多样性指数平均值为1.166,说明葛根样本遗传性状具有丰富的多样性。研究发现葛根遗传性状变异系数和Shannon-Weaver多样性指数变化不完全一致,其中成熟叶片花纹变异系数最大,遗传多样性指数最小,主茎粗遗传多样性指数最大,变异系数排名第9,究其原因,一是因为环境影响会导致遗传性状表达出现差异;其次,2种指标反应的内容不同,变异系数越高表明性状的离散程度越大、变异幅度越大,而多样性指数越高表明多样性程度越丰富、种类越多[28],这与谢向誉等[29]对广西食用木薯的研究结论相似。

多态性是评价分子标记的重要指标[30]。尚小红等[15]采用25条SCoT引物对44份广西葛根种质资源进行遗传多样性分析,多态性比率为86.99%;葛花[22]利用22对ISSR引物对137份葛根进行扩增,多态性比率为92.05%,而本研究对21份葛根种质资源进行ISSR分子标记分析,平均多态性比率为80.52%,多态性水平相对较低,原因可能是前人研究的葛根种质资源材料多,分布广,而本研究材料大部分来自广西,但是高于吴潇[31]研究的葛根多样性水平(多态性比率为74.55%),说明收集的21份葛根种质资源遗传多样性仍具有一定丰富度。本研究对21份葛根种质资源进行ISSR分子标记分析,其中PIC平均值为0.7800,Na平均值为1.7830;Ne平均值为1.3514;H′平均值为0.2160;I平均值为0.3353,说明种质资源具有较高杂合度,可能与葛根为雌雄异花授粉植物有较大关联。

3.2 葛根种质资源聚类分析

本研究对21份葛根种质资源进行了遗传性状与分子标记聚类分析。通过遗传性状与材料收集地理分布比对发现,I类材料均来自广西区内,II类材料和III类材料地理来源无规律,说明种质遗传性状与地理来源关联性不强,与刘林娅等[32]的研究结论一致。按照遗传距离进行UPGMA聚类与材料收集地理位置关联发现,部分葛根种质与地理位置有一定关联,如广西融安的G5与江西赣州的G18遗传距离最大(0.541),分别聚合在I和III类,同为广西梧州的G8和G9遗传距离最小(0.035)且最早被聚合到III类。通过遗传性状和ISSR分子聚类对葛根种质资源进行分析,发现表型聚类和分子聚类结果不一致。因此在鉴定种质资源时应该联合遗传性状和分子标记,以提高鉴定的准确性和可靠性。

3.3 葛根种质资源分子身份证构建

分子身份证是将种质分子指纹图谱抽象化,生成数字编号、条形码和二维码等,是一种现代化的便捷方法[33]。白晓倩等[24]构建了55份板栗品种的字符串、条形码和二维码3种DNA分子身份证,为板栗品种的识别和鉴定提供了依据;樊晓静等[26]利用SNP标记技术将DNA指纹图谱与品种资源基本信息相结合,构建了103份国内外不同类型的茶树品种分子身份证,对茶树品种资源区分和精准鉴定、分子数据数字化具有参考意义;吴仕蔓等[34]采用SSR扩增等位基因分子量和结合图谱带型方式构建了22份柚类资源分子身份证,为柚类种质资源鉴定和保护提供依据。目前对葛根种质资源DNA分子身份证构建的研究较少,本研究利用3对ISSR引物组合构建了21份葛根种质资源的字符串、条形码、二维码共3种DNA分子身份证,为葛根种质资源区分和精准鉴定及葛根种质资源DNA分子身份证的构建提供理论参考。

4 结 论

21份葛根种质资源具有丰富的遗传多样性和较高杂合度,可作为今后葛根品种选育基础材料。聚类分析可将供试葛根种质分成3类,部分种质与地理来源存在一定关联性,存在不同地域种质互相引进或交流。筛选出的P6、P17和P42可作为核心引物有效区分21份葛根种质资源,并构建分子身份证。