干燥温度对陈皮活性成分及表面细菌群落结构的影响＊

朱晓富，卢圣鄂，卓 维，刘 艳，任风鸣＊＊

（1.重庆中医药学院 重庆 402760；2.重庆市药物种植研究所 重庆 408435）

陈皮为芸香科植物橘（Citrus reticulataBlanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮[1]，具有理气健脾[2]、燥湿化痰的功效[3]，此外还具有良好的抗氧化[4]、抗菌[5]和心血管保护作用[6]。同时，陈皮是药食两用品种，常作为茶饮和休闲食品使用，市场需求十分广泛[7]。陈皮在采收季节阴冷多雾、空气潮湿，鲜橘皮靠自然晾晒时间长、容易霉变，影响药材品相和质量。随着中药材加工技术的发展，热风循环干燥机逐步得到应用。热风循环干燥不受天气条件影响，干燥速度快，干燥条件可控[8]。然而在干燥过程中，干燥的温度和时间可能对陈皮中成分含量有影响，尤其是对陈皮中挥发性成分[9]。同时，相关文献报道微生物参与了陈皮的陈化过程，能够转化陈皮中化学成分从而使活性物质含量增加，而干燥温度往往对陈皮表面微生物造成影响，改变陈皮陈化初期的微生物结构[10-11]。目前关于陈皮的研究主要集中在不同品种、不同陈化期药材指标成分橙皮苷的含量，而干燥温度对陈皮总体化学成分差异和表面微生物的影响少有报道[12]。

本研究以重庆万州产鲜红橘皮为研究对象，考察不同干燥温度下陈皮的干燥速率，测定主要活性成分及挥发性成分含量，明确干燥温度对陈皮中成分的影响。并通过高通量测序技术分析不同干燥温度下陈皮表面细菌群落结构及多样性，揭示干燥温度对陈皮表面细菌群落结构的影响。本研究为陈皮的加工干燥提供了依据和参考，有助于陈皮药材质量提升。

1 材料与方法

1.1 样品及其制备

实验用陈皮于2021 年12 月采摘于重庆市万州区小周镇，经重庆市药物种植研究所刘正宇研究员鉴定为芸香科植物橘（Citrus reticulataBlanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮。选择2.5 kg 果形大小一致、无破损、无腐烂的新鲜红橘，混合均匀，清洗干净，手工扒皮，等分4 瓣，基部相连。平铺铁丝网中，置于预先设置好温度（35、45、55、65℃）的烘箱内，每组实验设置3 个重复，并且分别在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h 取出少许样品用于测定水分；干燥得到A、B、C、D四组样品，标准仓储中心常温储存6 个月用于测定表面微生物。

1.2 主要试剂

橙皮苷（批号：520-26-3，含量≥98%）购自四川省维克奇生物科技有限公司；桔皮素（批号：481-53-8，含量≥98%）购自上海麦克林生化科技有限公司；川陈皮素（批号：478-01-3，含量≥98%）购自四川省维克奇生物科技有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯；水为双蒸水。

1.3 主要仪器

Waters2695 型高效液相色谱仪HPLC（沃特世公司）；QP2010 型气质联用仪GC-MS（日本岛津）；GS-100A 型超声波提取器（深圳市歌能清洗设备有限公司）；Agilent Extend-C18 型色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）（美国安捷伦公司）；SX2-8-10NP 型电阻炉（上海恒科仪器公司）；Biorad T100 型梯度PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）；JB-CJ-1000FX 型洁净工作台（苏州佳宝净化工程设备有限公司）；DGL-75B 型立式高压灭菌锅（江苏登冠医疗器械有限公司）；BP121S型电子分析天平（十万分之一，德国赛多利斯公司）；GZX-9246MBE 型电热鼓风干燥箱（上海博迅有限公司医疗设备厂）；HH-S4 型数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂）。

1.4 方法

1.4.1 干基含水率（Mt）

按照公式进行计算：Mt＝(wt-m干)/m干

m干为干燥后陈皮质量（g），wt为t 时刻的陈皮质量（g）[13]。

1.4.2 HPLC测定橙皮苷、桔皮素、川陈皮素含量

（1）HPLC 分析条件：色谱柱：Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm, 5 μm）。橙皮苷含量测定法：流动相（乙腈∶水=22∶78）；流速（1 mL·min-1）；波长（283 nm）[14]；桔皮素、川陈皮素含量测定法：流动相（A：乙腈；B：水）；梯度洗脱（0 min, 20% A; 15 min，25% A; 35 min,45% A; 45 min, 45% A; 60 min, 75% A; 80 min, 95%A）；流速（1 mL·min-1）；波长（330 nm）[15]。

（2）对照品溶液：称取橙皮苷、川陈皮素、桔皮素标准品，置于容量瓶中，甲醇定容，得到橙皮苷质量浓度0.44 mg·mL-1、川陈皮素质量浓度0.29 mg·mL-1、桔皮素质量浓度0.72 mg·mL-1的对照品溶液。

（3）供试品溶液的制备：精密称量陈皮切片样品细粉约0.2 g，置三角瓶中，甲醇溶液25 mL 浸泡，超声处理（功率300 W；频率40 kHz）45 min，放冷，摇匀，滤过，即得[15]。

（4）陈皮饮片中橙皮苷、川陈皮素、桔皮素含量测定：制备不同干燥温度陈皮样品供试品溶液，分别进行HPLC分析，每次进样10 μL，记录峰面积，计算橙皮苷、川陈皮素、桔皮素含量[15]。

（5）高效液相色谱方法学考察：①精密度检查：对照品溶液重复进样5 次，每次10 μL，计算RSD 结果。②重现性检查：选择已知橙皮苷、川陈皮素、桔皮素含量的陈皮样品，制备供试品溶液，每次10 μL 进样，计算RSD 结果。③稳定性检查：制备供试品溶液，分别在0 h、4 h、8 h、16 h 和24 h 范围内进行实验，每次10 μL进样，计算RSD 结果。④回收率实验：选择已知含量的陈皮药材0.2 g，制备供试品溶液，准确添加适量橙皮苷、川陈皮素、桔皮素，计算RSD 结果。⑤线性关系考察：对照品溶液分别稀释1 倍、2 倍、4 倍、8 倍、16 倍，进样测定，以峰面积对对照品的浓度做工作曲线，得回归方程。

1.4.3 GC-MS分析测定陈皮中主要挥发性成分

（1）GC-MS 陈皮样品溶液制备：准确称取陈皮粉末约2.0 g，加入10 mL甲醇，超声45 min，通过0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

（2）GC-MS分析条件：QP2010气相色谱质谱联用仪（日本岛津），石英毛细管柱（Rtx-5MS: 30 m×0.25 mm），柱初温（60℃），保持（1 min），升温速率（6℃·min-1），柱终温（260℃），保持（15 min），载气（He），分流比（50∶1），进样量（2 μL）。MS 条件：离子源（EI），电子能量（70 eV），扫 描 范 围（45～600 m/z），离 子 源 温 度（200℃），接口温度（260℃），以上参照刘丽娜等[16]。

1.4.4 陈皮表皮细菌群落结构及多样性

（1）陈皮微生物总DNA 提取和PCR 扩增：参照张鑫等[17]提取陈皮样品的总DNA，以其为模板，使用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）为引物对16S rRNA V3-V4 区进行扩增，扩增体系为20 μL（4 μL 5×Fastpfu Buffer，2 μL 2.5 mmol·L-1dNTP，0.8 μL 10 ng/μL引物338F 和806R，0.4 μL Fastpfu Polymerasem，0.2 μL BSA，10 ng DNA）。利用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

（2）文库制备与上机测序：采用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制备测序文库，构建好的文库经检测合格后，使用Novaseq-PE250 测序平台测序，委托上海派森诺生物科技股份有限公司完成。

1.4.5 数据分析

数据采用SPSS22.0（New York，美国）进行实验数据统计分析，显著性分析采用单因素方差分析（ANOVA）。序列分析使用QIIME（Version 1.7.0）软件包进行Alpha 多样性分析，Beta 多样性分析，观察到的物种种类observed-species、Shannon、Simpson、Chao1、Goods_coverage 和Pielou_e 共6 个指标用来表征物种的α-多样性，采用R 软件（Version，2.15.3）进行计算。Venn 图、相对丰度分析和20 个优势细菌属的热图分析也由R软件（Version，2.15.3）分析和生成[18-19]。

2 结果与分析

2.1 温度对陈皮干燥过程的影响

电热鼓风干燥箱在不同温度下干燥陈皮，起初陈皮含水率在70%左右，干燥10 h 后，水分稳定在10%左右；在干燥过程，陈皮相对含水率逐渐降低，并且在干燥过程中前5 h 含水率下降的速度快于后5 h；不同干燥温度下含水率的差异显著，干燥温度的越高，水分蒸发速度越快，含水率越小，达到稳定含水率的时间越短（见图1）。

图1 不同干燥温度下陈皮相对含水率随时间变化曲线

2.2 HPLC法测定橙皮苷、桔皮素、川陈皮素含量方法学考察结果

通过方法学考察确定仪器精密度，重复性均良好，样品处理后24 h 内吸光度较稳定，且加样回收率较理想，线性关系考察结果表明橙皮苷进样量在0.0275-0.4400 mg·mL-1范围时、川陈皮素进样0.0181-0.2900 mg·mL-1、桔 皮素 进样0.0494-0.7900 mg·mL-1范围时呈现良好的线性关系（见表1）。说明应用HPLC 法可适用于陈皮中的橙皮苷、川陈皮素、桔皮素含量测定。

表1 HPLC方法学考察结果表

2.3 陈皮中橙皮苷、川陈皮素、桔皮素含量测定及结果

不同干燥温度陈皮中橙皮苷、川陈皮素、桔皮素总含量稳定在4.74%左右。不同干燥温度3 种黄酮成分含量有一定差异，橙皮苷相对含量最高3.8%左右，桔皮素相对含量0.7%左右，川陈皮素相对含量最少0.22%左右，随着干燥温度升高，川陈皮素含量有上升趋势。HPLC 色谱图见图2；陈皮中橙皮苷、桔皮素、川陈皮素的含量见表2。

表2 陈皮中橙皮苷、川陈皮素、桔皮素的含量表

图2 各成分HPLC色谱图

2.4 GC-MS分析不同干燥方法陈皮化学成分

陈皮样品GC-MS谱图中，依次对物质含量高的色谱峰同时峰型完整的色谱峰积分，对所积分色谱峰开始质谱扫描，质谱数据系统检索（质谱数据库NIST08s.LIB），综合分鉴定出陈皮中15 种主要成分（见图3）。同时，用峰面积归一化法测定各个陈皮样品中各种化学成分相对含量，不同干燥方法陈皮GC-MS 成分分析表3。

表3 不同干燥温度陈皮成分分析结果

图3 陈皮的GC-MS色谱图

采用GC-MS 法分析鉴定出陈皮中15 种成分，通过本方法测定d-柠檬烯在陈皮中相对含量最高，其含量占11%左右，是陈皮中主要的特征成分，与前人研究结果一致，具有新鲜的类柠檬香气[20]。四种干燥温度下陈皮中挥发性成分含量具有一定的差异，干燥温度越高，挥发性香气成分占比越低，如月桂烯、芳樟醇、香芹酚、α-甜橙醛，随着干燥温度升高，含量占比有下降趋势，尤其在55℃、65℃干燥温度下陈皮样品中主要挥发性香气成分占比显著低于在35℃干燥温度下陈皮样品，且3-蒈烯只在35℃干燥陈皮中检测到。而α-蒎烯、d-柠檬烯、角鲨烯等成分随着干燥温度升高，其在陈皮中的含量无明显变化。

2.5 陈皮表面细菌群落结构及特征

2.5.1 陈皮OTU聚类分析和细菌α-多样性

通过对16SV3V4 区进行测序，去除低质量、Barcode 和引物序列后，样品得到有效序列总数为315317 条。从图4 韦恩图可以看出，四组之间有共同的5 个OTUs，A 组有27 个特有的OTUs，B 组有35 个特有的OTUs，C组有28个特有的OTUs，D组有28个特有的OTUs。从表4可以看出，在不同干燥温度下Chao1、Observed species_Shannon、Simpson、Goods_coverage、Pielou_e 和Shannon 均具有显著差异。说明陈皮的陈化干燥温度对陈皮细菌的多样性有一定的影响，在陈皮干燥过程中，随着干燥温度的提高，细菌的Shannon指数和Shannon指数变化总体上呈上升趋势。

表4 陈皮表面细菌α-多样性

图4 陈皮表面细菌OUT数量关系

2.5.2 不同分类水平上相对丰度分析

不同干燥温度陈皮门水平细菌群落组成如图所示，变形菌门Proteobacteria，拟杆菌门Bacteroidetes，放线菌门Actinobacteria等优势细菌。Proteobacteria为干燥过程中的绝对优势菌门，不同干燥温度陈皮所有样本相对丰度均在55%以上。在细菌属水平上，主要分布为嗜盐单胞菌属Halomonas，甲基杆菌属Methylobacterium，耐盐远洋杆菌Pelagibacterium，卟啉菌属Porphyromonas等（见图5）。

2.5.3 不同干燥温度陈皮细菌聚类分析

选取丰度排名前20的细菌属，根据每个样本各属的丰度均值，分别对样本之间细菌相对丰度进行聚类分析，得到热图。图中可知，卟啉菌属Porphyromonas、Rodentibacter在A 组中最为丰富，耐盐远洋杆菌Pelagibacterium，嗜盐单胞菌属Halomonas，涅斯捷连科氏菌属Nesterenkonia，在B 组中最为丰富，Corynebacterium、Fusobacterium、Hymenobacter薄层菌属、Actinomyces放线菌属、Methylobacterium甲基杆菌属、Sphingomonas鞘氨醇单胞菌属在C 组中最为丰富，P3OB-42、1174-901-12、Filifactor在D组中分布较多（见图6）。

图6 陈皮细菌丰度前20的菌属相对丰度Heatmap

3 结论与讨论

3.1 干燥温度对陈皮黄酮类成分的影响

本研究采用HPLC 法测定不同干燥温度下陈皮中的橙皮苷、川陈皮素和桔皮素含量，研究不同干燥温度对陈皮中3 种化合物含量影响。结果表明，干燥温度变化对陈皮中橙皮苷、桔皮素含量影响甚少，但川陈皮素含量随着干燥温度升高有上升趋势。川陈皮素具有抗血细胞凝集、抗炎、抗氧化应激和肿瘤抑制作用[21-22]。那么，川陈皮素含量升高是否引起陈皮抗氧化作用增强仍有待研究。同时，也有学者认为不同干燥方式对陈皮黄酮的影响与制备陈皮的果实品种有关：对于新会茶枝柑陈皮，不同干燥方式对陈皮黄酮类化合物总含量无显著性差异；对于福建芦柑陈皮，热风干燥制备陈皮相比自然晾晒制备陈皮含有更高含量的黄酮类化合物[23]。而本研究表明，不同干燥温度对陈皮中橙皮苷、桔皮素含量无显著影响，这可能与大红袍陈皮品种特性有关。

3.2 干燥温度对陈皮挥发性成分成分的影响

陈皮中挥发性成分也是陈皮主要功效成分之一，主要分布于陈皮表皮油室组织中[24]。刘素娟[25]研究发现，不同干燥方式陈皮中挥发油含量：冷冻干燥＜晒干＜减压干燥＜60℃烘干＜40℃烘干，说明陈皮中挥发油含量与干燥方法、温度有关。本研究利用GC-MS分析鉴定出陈皮中15 种主要成分，d-柠檬烯含量最高，占11%左右，与前人的报导结果一致[26-27]。其中陈皮中主要挥发性香气成分月桂烯、芳樟醇、香芹酚、α-甜橙醛，随着陈皮干燥温度升高，含量占比有下降趋势，尤其在55℃、65℃干燥温度下，下降较为显著，且3-蒈烯只在35℃干燥陈皮中被检测到。相关研究显示，陈皮在60℃以上干燥条件下与低温干燥相比挥发性成分差异较大，部分成分可能转化成烯类成分[28]。陈皮中主要挥发性香气成分含量下降，可能与干燥温度过高，挥发性成分受热不稳定发生转化或被破坏有关。

3.3 干燥温度对陈皮表面细菌群落结构的影响

本研究发现不同干燥温度陈皮表面细菌组成结构基本一致，但相对丰度差异显著，优势菌群不同。在门水平上，Proteobacteria是陈皮陈化过程中表面主要优势细菌门，随着干燥温度升高，Proteobacteria菌门丰度有上升趋势。在属水平上，不同干燥温度陈皮表面优势菌群在不断演变。随着干燥温度升高，以Halomonas、Porphyromonas为优势的菌属逐步转变为以Methylobacterium为主。而Methylobacterium、Sphingomonas、Stenotrophomonas菌属与陈皮多种挥发油的代谢相关，有研究表明这些菌属可加速挥发油的生物转化[29-31]。因此，不同干燥温度对陈皮表面菌群影响可能会引起后期陈化过程中挥发性成分变化。此外，有研究表明微生物会引起陈皮黄酮类成分含量变化[32]。本研究发现川陈皮素含量随着干燥温度升高有上升趋势，这可能与不同温度下陈皮表面菌群的变化有关，相关结果还有待进一步探讨。