棉花细胞质雄性不育的胞质效应研究现状及未来展望

李博，张梦，张学贤，郭立平，戚廷香，唐会妮，王瑞杰，王海林，乔秀琴，吴建勇，邢朝柱

（中国农业科学院棉花研究所/ 棉花生物育种与综合利用全国重点实验室/ 农业农村部棉花生物学与遗传育种重点实验室，河南安阳 455000）

棉花作为一种重要的经济作物，是纺织工业的主要原料，在我国国民经济中占有重要地位[1]。同其他作物一样， 棉花具有明显的杂种优势，强优势杂交组合的F1可比常规棉品种增产15%左右[2-3]。 目前，生产上大面积推广种植的棉花杂交种大多数是由人工去雄授粉获得。 近年来，由于劳动力成本不断上涨，生产上推广人工去雄制备杂交种难以为继，给棉花杂种优势利用研究带来了新的机遇和挑战[4]。

细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility,CMS）是一种经济且有效的授粉控制系统。 利用CMS 杂交制种技术不但能够省去人工去雄成本，而且可有效提高大面积制种的纯度。 目前该技术已经在水稻、玉米、棉花、油菜、高粱、辣椒等作物中取得较大的进步[5-6]。 棉花CMS 系主要有哈克尼西棉（Gossypium harknessii）[7-9]、三裂棉（G.trilobum）[10]、陆地棉（G.hirsutum）[11]、海岛棉（G.barbadense）[12]和异常棉（G.anomalum）[13]不育胞质等多种类型。 目前，只有哈克尼西棉、陆地棉和三裂棉的胞质不育系实现了不育系、 保持系和恢复系 “三系” 配套， 其中哈克尼西棉不育胞质（CMS-D2）是生产上推广种植的棉花“三系”杂交种的主要胞质来源[14]。随着棉花不育系、保持系和恢复系的成功创制、回交改良和“三系”配套，我国在胞质不育“三系”杂交棉研究与育种应用方面均走在了世界前列[15]。近年来，国内棉花育种家已成功培育出一系列强优势的“三系”杂交棉品种，如国审棉银棉2 号[16]、邯杂98-1[17]、邯杂301[18]、中棉所99[19]、鲁杂2138[20]以及省审棉浙杂2 号[21]、中棉所83[22]和运B259[23]等。然而，由于棉花CMS 恢复源狭窄以及不育细胞质对F1的产量性状等具有一定的负效应等问题，“三系” 杂种棉在我国主产棉区推广应用进展缓慢。 此外，CMS-D2 恢复系的花药发育易受外界环境影响[1,24-26]。如夏季持续高温胁迫会引起棉花授粉受精能力下降、蕾铃脱落，最终导致产量锐减，这大大限制了“三系”杂交种在生产上的大面积推广应用。因此，本研究通过系统分析棉花雄性不育细胞质对主要性状的影响及其负效应产生的分子基础， 探讨克服甚至消除棉花雄性不育细胞质负效应的潜在育种对策，从而为选育优良的棉花细胞质雄性不育系、恢复系和强优势的“三系”杂交种提供理论依据。

1 棉花雄性不育细胞质对主要性状的影响

1.1 农艺性状

棉花苗期主要以营养生长为主，进入蕾期后处于营养生长和生殖生长的并进时期。 有学者报道，CMS-D2 不育胞质对棉花苗期生长及生物量积累无明显影响[27]。 赵存鹏等[28]也认为陆地棉雄性不育细胞质对棉花株高无显著影响，但使生育期延长、果枝数增加。 此外，华金平等[29]以具有8个不同棉种细胞质的中棉所7 号（陆地棉）同核系为研究材料发现，与陆地棉胞质系相比，哈克尼西棉胞质系花蕾瘦小，而异常棉胞质系和亚洲棉胞质系的花蕾则表现为尖削、瘦长。王学德等[30]研究表明，与可育胞质杂交组合的F1相比，不育胞质杂交组合F1的单粒花药平均体积变小，百粒花药的干物质质量降低。 综合来看，雄性不育细胞质对棉花农艺性状无明显的负效应，但异源细胞质对陆地棉花器官的形态具有一定影响[31]。

1.2 叶片光合特性

光合作用对植物生长发育和作物产量形成至关重要，目前关于雄性不育细胞质对棉花光合特性影响的研究报道较少。 左志丹等[27]在河南安阳和江西九江试验点系统研究了CMS-D2 不育胞质对棉花全生育期主茎功能叶光合特性的影响，发现在苗期不育胞质能显著促进棉花的光合作用；进入花铃期以后，不育胞质对光合作用的负效应开始显现，主要表现为不育胞质恢复系在花铃期和吐絮期的叶片净光合速率显著降低，这可能间接影响棉花产量形成。 赵海燕[32]认为在光合特性方面，从蕾期到吐絮期，棉花CMS 系亚棉A 的叶片净光合速率均显著低于相应的保持系亚棉B；与保持系相比，不育系叶片的气孔导度在蕾期和吐絮期均明显较高，而在开花期和结铃期较低；除蕾期外，在其他生育时期不育系叶片的蒸腾速率和胞间CO2浓度均显著低于保持系。这些差异可能是由于该不育系的不育细胞质与细胞核存在互作，使与光合调控相关基因的时空表达及其功能发生了一定变化。

1.3 花药发育状况

棉花CMS 系的育性恢复能力直接关系着“三系”杂交棉收获期的成铃数和最终产量。 已有大量研究报道，棉花花药发育和花粉育性易受夏季高温胁迫影响，主要表现为花药不开裂、花粉败育以及萌发活力降低[1,26-27,33-34]。 棉花CMS-D2不育胞质恢复系和“三系”杂交种的花药发育过程不仅受不育细胞质、恢复基因和育性增强基因的调控[35-36]，而且受细胞核遗传背景和外界环境条件（如夏季高温）影响[1,24-26]。 前人对此也开展了诸多研究。 例如，王学德等[30]发现CMS-D2 不育细胞质对不育系与恢复系杂交F1的育性具有一定程度的负效应，主要是引起雄配子败育和降低雌配子育性[37]。 张学贤等[38]选用3 个CMS-D2 不育胞质型恢复系及其同质异核的3 个可育胞质型恢复系进行研究发现，在高温胁迫下不育胞质型恢复系的多粉花率和籽棉产量均显著低于可育胞质型恢复系，并且指出籽棉产量与多粉花率直接相关。 另有研究报道，在高温胁迫下CMSD2 不育胞质恢复系的多粉花率、 可育花粉率和花粉体外萌发率均极显著低于陆地棉可育胞质恢复系，尤其在长江流域棉区表现更为明显[27]，这说明夏季温度越高，不育胞质对盛花期花药发育的负效应更加凸显[24-25,38]。此外，在高温胁迫下，三裂棉CMS（CMS-D8）恢复系花粉育性比孢子体不育的CMS-D2 恢复系表现更为稳定[1,26,39-40]，这说明棉花CMS-D8 胞质杂种F1的花药发育过程可能具有更好的高温耐受性。

1.4 产量性状

早期国内外学者关于雄性不育细胞质对棉花产量及其构成因素的研究结果分歧较大[41-42]，但后续大量研究报道表明， 不育胞质对籽棉产量、皮棉产量和衣分均有显著的负效应[19,27,30,46-47]。利用哈克尼西棉不育系及恢复系配制的杂种F1平均减产5%～8%[44]。 王江林等[46]的研究结果表明，三裂棉（D8）不育胞质对籽棉和皮棉产量具有极显著的负效应， 同时对衣分也表现出负效应。有学者研究发现不育胞质对棉花单株铃数无明显不利影响[28,46]，但是王学德等[30]、左志丹等[27]和周曙霞等[48]认为不育胞质对棉花单株铃数具有显著的负效应。 王江林等[46]认为D8 不育胞质对棉花的铃重表现为负效应，但另有研究发现不育胞质对棉花铃重的影响并不显著[27-28]。 这些差异可能是由于不同棉种CMS 的胞质效应对产量性状的影响不尽相同，并且这种胞质效应还受细胞核遗传背景和外界环境条件（如温度）的影响[24-26]。

1.5 纤维品质性状

近年来，研究人员就雄性不育细胞质对棉花纤维品质性状的影响进行了大量研究[27-28,46,48-49]。赵存鹏等[28]以转基因抗虫棉常规品种冀2658 及其同核异质不育系冀2658A 为母本、以6 个恢复系为父本，配制了12 个杂交组合，结果表明陆地棉雄性不育细胞质对棉纤维的断裂比强度及断裂伸长率具有显著负效应，而对纤维上半部平均长度、 长度整齐度指数和马克隆值无显著影响。周曙霞等[48]以陆地棉保持系和哈克尼西棉胞质不育系为亲本配制42 个杂交组合， 研究表明哈克尼西棉的胞质效应广泛存在，主要对杂交F1棉纤维的2.5%跨距长度、马克隆值有显著负效应。 另有学者发现CMS-D2 不育胞质对杂种F1的纤维长度具有一定的正效应[49]。 左志丹等[27]为排除细胞核背景影响，选用2 套同核异质的哈克尼西棉恢复基因近等基因系为材料，发现CMS-D2 不育胞质总体上对棉花纤维品质性状无明显的不利影响。 此外，王江林等[46]认为三裂棉D8 不育胞质对纤维上半部平均长度和长度整齐度指数无显著影响，但可显著提高纤维断裂比强度和断裂伸长率，并降低马克隆值，说明三裂棉不育胞质对棉纤维品质性状无明显不利影响，还可在一定程度上改善纤维细度和强度。

1.6 抗逆性

相比亲本， 棉花杂交种具有更强的抗逆性，但目前关于雄性不育细胞质对棉花抗逆性影响的研究报道较少。 赵存鹏等[28]的研究结果表明陆地棉雄性不育细胞质对黄萎病发生具有一定的抑制作用，但对枯萎病的发生无显著影响。 另有研究报道， 与CMS-D2 不育胞质型恢复系相比，陆地棉正常胞质型恢复系的花药发育具有更强的耐高温性能[27,38]。

2 棉花不育胞质效应产生的分子基础

2.1 生理生化变化

正常的生理生化过程是植物生长发育的基础。 目前关于棉花雄性不育胞质对植株生理生化指标的影响已有大量研究[28,32,50-51]。 例如，赵存鹏等[28]利用同核异质的F1探究冀2658A 雄性不育细胞质对棉籽粗蛋白和粗脂肪含量的影响，结果表明冀2658A 雄性不育细胞质对棉籽粗脂肪含量有显著负效应，而对棉籽粗蛋白含量无显著影响。黄晋玲[50]对与线粒体有关的过氧化物酶、细胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶和琥珀酸脱氢酶的活性进行分析，发现晋A 不育系在花粉发育各个时期的酶活性与其保持系相比，均明显降低，这说明酶活性变化可能与雄性不育发生有关。冯义军等[51]的研究结果表明，与同核异质的F1材料相比，含有哈克尼西棉不育胞质的F1在开花期叶片的叶绿素含量、可溶性蛋白质含量、淀粉含量以及光合强度均显著升高，而可溶性糖含量和呼吸强度显著降低，这说明含有CMS-D2 不育胞质的F1具有较高的光合强度和较低的呼吸强度，从理论上来说有利于光合产物的积累。 此外，含有哈克尼西棉不育胞质的F1在开花期叶片中的淀粉酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的活性均显著低于其同核异质F1材料，但多酚氧化酶活性显著高于其同核异质F1材料。王学德[52]发现从造孢细胞增殖期至花粉成熟期，不育花药中的淀粉和可溶性糖含量未发生明显变化，与保持系的可育花药中的淀粉和可溶性糖含量的变化趋势明显不同。 此外，解海岩等[53]发现保持系、恢复系和杂种F1的可育花药的内源激素含量无显著差异；与可育花药相比，不育花药中吲哚乙酸、赤霉素和玉米素核苷的含量均降低，而脱落酸含量升高，这种差异在花粉母细胞败育时期达到最大，说明花药中内源植物激素含量异常与雄性不育密切相关。 但目前关于植物激素如何精确调控棉花雄性不育发生的具体机制仍知之甚少。

2.2 转录和代谢水平的变化

基于CMS 的杂交后代通常比常规杂交种表现出更明显的细胞质效应，“三系”杂交种产量形成主要取决于作物CMS 育性恢复能力的强弱。近年来，关于不育胞质在转录、转录后和代谢等水平上如何影响花药发育已有一些研究报道[54-56]。 在大豆中， 糖信号- 光敏色素互作因子（phytochrome interaction factor,PIF）-生长素信号转导途径可能是高温胁迫下导致不育胞质杂种F1雄性育性不稳定的潜在原因。 此外，GmHSFA2作为一个正调节因子，可能直接参与高温胁迫下大豆CMS 杂种F1花粉育性保护机制的激活[56]。Ding 等[55]通过小RNA 和转录组测序分析发现，在大豆中21 个差异表达的微小RNA（microRNA,miRNA）和15 个差异表达的靶基因之间存在负调控关系，如gma-miR397a/ 漆酶2、gma-miR399a/无机磷酸盐转运蛋白1-4 和gma-miR4413a/PPR蛋白基因可能在高温胁迫下参与调控大豆不育胞质杂种F1的雄性育性稳定性。 研究发现gmamiR156b 负调控其靶基因GmSPL2b的表达，并且gma-miR156b 过表达拟南芥在高温胁迫下表现为雄性不育[57]。 近期中国农业科学院棉花研究所的专家团队通过对保持系NB、 同核异质近等基因恢复系NH 和SH 在河南安阳和江西九江环境下的成熟花粉进行非靶向代谢组学和转录组学联合分析，发现CMS-D2 不育胞质对花粉育性的负效应主要是由于质核互作效应诱导关键转录因子如WRKY22、WRKY53和ARF18等的上调表达，使脂质代谢特别是不饱和脂肪酸的代谢平衡被破坏，引起茉莉酸含量降低，最终导致花粉育性下降，但具体的调控机制尚不清楚，有待进一步深入研究。 同时，在CMS-D2 不育胞质存在的情况下，细胞质- 细胞核的相互作用产生了大量的黄酮类化合物，可能参与花粉育性恢复过程[54]。

3 克服棉花不育胞质负效应的潜在途径

棉花不育胞质的负效应主要集中在花药发育和产量等性状上， 尤其是在高温胁迫下棉花CMS 育性恢复稳定性直接决定最终的成铃数和产量[27]。 目前生产上推广利用棉花CMS-D2 胞质不育“三系”杂交种F1的主要限制因素是由于其花粉育性较差（总花粉量偏少，可育花粉率和花粉萌发活力偏低），进而影响棉花双受精过程，引起结铃率低、不孕籽率高，最终表现为单株铃数减少、铃重降低，导致籽棉产量下降，这种现象在夏季温度更高的长江流域棉区表现更为明显[25-27]。因此，明确不育胞质效应及其影响因素，可为棉花“三系”杂交种的选育与改良奠定重要理论基础。 对此，可以采取常规育种与生物育种相结合的方法来选育和改良亲本（不育系和恢复系），辅助一定的栽培技术措施缓解高温胁迫下不育胞质对杂交种花药发育的负效应，并加强棉花新型配子体胞质不育类型CMS-D8 相关的基础研究及育种价值评估等，从而推动“三系”简化制种技术在我国杂交棉生产中的进一步推广应用。

3.1 选择适宜的生态区推广种植“三系”杂交种

已有研究报道，棉花CMS-D2 不育胞质对产量等性状存在一定的负效应，在高温胁迫下表现更为明显[27]。具体来说，CMS-D2 胞质负效应在夏季温度相对较低的黄河流域棉区表现较弱，但长江流域棉区盛花期极端高温会引起不育胞质恢复系和“三系”杂交种的花药不开裂、总花粉量减少和花粉育性降低，具体表现为授粉受精能力下降、棉铃结实率降低，最终直接导致棉花产量锐减[25-26]。 因此，可在不同生态环境下对“三系”亲本和特定杂交组合进行系统育种评价，在适宜的生态区筛选出一些较人工去雄授粉杂交种具有增产潜力的“苗头”杂交组合[15]。近年来，国内育种家已陆续培育出了一系列适于黄河流域棉区种植综合性状表现较好的国审 “三系” 杂交棉品种[18-20]，但适于长江流域棉区推广种植的“三系”杂交种的选育尚比较困难。

3.2 通过置换细胞核遗传背景改良恢复系

不育胞质效应与核基因型密切相关，相同胞质型与不同核基因型结合，对棉花同一性状的遗传效应可能不尽相同[15,37]。 利用远缘杂交和回交等手段， 目前已获得了恢复基因分别来自三裂棉、异常棉和瑟伯氏棉（G.thurberi）的恢复系，并从海岛棉品种Pima S-4 中发现了育性增强基因E[35]。 因此，可通过有性杂交方法将多个恢复基因Rf和海岛棉育性增强基因E聚合到高产优质抗虫棉品种（系）中，从而培育出对多种胞质不育类型均具有强恢复力的新型恢复系[58]。此外，利用中国农业科学院棉花研究所历经多年研究成功建立的“三系” 分子标记辅助选择（marker-assisted selection,MAS）育种体系对不育基因和恢复基因进行跟踪[7,9,39-40,58,60]，引入耐高温等优异棉花种质资源对“三系”杂交种双亲（尤其是恢复系）的细胞核遗传背景进行回交改良和多年多环境交叉选择。 通过不育系与恢复系的广泛测交，尽量减少甚至消除不育胞质对“三系”杂交组合主要经济性状的负面影响，最终选育出适于我国主产棉区推广种植的“三系”杂交种是切实可行的[15]。

3.3 通过细胞质置换降低不育胞质的负效应

在棉花中，除了生产上推广种植的CMS-D2胞质不育“三系”杂交种外，还有陆地棉[11]（通过种间杂交获得）、海岛棉（利用外源基因导入）[12]以及三裂棉[10]和异常棉[13]（通过远缘杂交获得）等多种胞质不育类型被成功创制。 其中通过陆地棉与海岛棉种间杂交获得的陆地棉胞质不育系已经实现了“三系”配套[61]和杂交棉品种审定，如国审棉银棉2 号[16]、邯杂98-1[17]和邯杂301[18]。此外，赵存鹏等[28]的研究也发现陆地棉不育细胞质对杂种F1的单株铃数和铃重等产量性状无显著影响。 因此，以陆地棉胞质不育系为母本、以优良CMS-D2保持系为父本，利用有性杂交和多代回交方法将对应CMS-D2 不育系的细胞质替换为陆地棉不育胞质类型， 并利用MAS 育种技术追踪不育基因和改良不育系，也是降低CMS-D2 不育胞质负效应的潜在有效途径。

3.4 利用细胞工程育种技术定向增强“三系”亲本的耐热性

蛋白质组学分析表明，热休克蛋白70-17（heat shock protein 70-17,HSP70-17）和结合蛋白5（binding protein 5,BiP5）通过减少花药中活性氧的积累提高高温胁迫下棉花雄性育性[62]。 在CMS-D2 胞质存在的情况下，质核互作效应可能增加参与育性恢复过程的类黄酮的合成，并诱导关键转录因子如WRKY22、WRKY53和ARF18的上调表达，破坏下游脂质代谢的平衡，最终导致恢复系花粉育性下降[54]。近期，中国农业科学院棉花研究所成功建立了跨越棉属种间/ 种内、无基因型限制的棉花高效遗传转化体系——种子顶端分生组织细胞介导的转化（shoot apical meristem cell-mediated transformation,SAMT），转化周期缩短至2～3 个月， 这为加速棉花功能基因研究和基因工程育种进程提供了重要技术保障[63]。因此，可利用SAMT 转化体系在已审定“三系”杂交种（如优质棉中棉所99）亲本中过表达耐高温转录因子（如HSPs）或通过基因编辑敲除温度敏感型转录因子（如WRKY53）等，增强花药发育对高温的耐受性，从而降低高温胁迫下不育胞质的负效应。

3.5 通过栽培管理措施缓解高温胁迫下不育胞质的负效应

植物花药发育对高温的响应机制十分复杂，其中内源植物激素包括生长素[34,64]和茉莉酸[65]等参与调控花药发育对外界高温的响应过程。 在棉花中，高温引起花药不开裂和花粉败育，主要是由于过度激活的生长素信号[34]以及茉莉酸合成和代谢平衡受到破坏[54,65]。 因此，在极端高温天气来临前，可对盛花期的棉株喷施适宜浓度的茉莉酸甲酯或生长素抑制剂等，在一定程度上缓解高温胁迫下不育胞质对“三系”杂交种花药发育的负效应，以增加成铃数和产量。

3.6 加强棉花新型配子体胞质不育的基础研究及育种应用

三裂棉CMS（CMS-D8）是一种新型的棉花胞质不育类型，目前也已经实现了“三系”配套，其恢复系的育性相比孢子体不育类型的CMSD2 胞质恢复系在高温下表现更为稳定[26,39-40]。 此外，CMS-D8 属于配子体不育类型， 不育胞质杂种F1自交所得F2群体中不会出现不育株[66]，因此在当前新疆主产棉区机械化密植条件下具有潜在的育种应用价值[1]。 关于棉花CMS-D8 系统，中国农业科学院棉花研究所近年来在不育基因和恢复基因定位以及分子标记开发等方面已取得一系列进展[39-40,60,67]。 当前，应继续加强棉花CMS-D8 不育及其育性恢复机理研究，同时通过常规育种与MAS 育种技术相结合， 加快推进CMS-D8 不育系和恢复系的回交改良以及 “三系”杂交棉新品种选育工作。

4 前景展望

利用杂种优势可以显著提高棉花产量、改善纤维品质和增强抗逆性等[68]。 目前生产上推广种植的主要是人工去雄授粉获得的棉花杂交种，其种植面积仅占我国植棉面积的10%左右。 劳动力成本逐年攀升，为生产上大面积推广利用人工去雄授粉制种技术获得的杂交种带来了不利影响[4]。因此，简化、高效、低成本的棉花制种方法已成为我国杂交棉发展的必然要求。 利用CMS-D2“三系法” 开展杂交制种可以很好地解决这一问题，既能免去人工去雄成本，又能通过大面积制种有效提高杂交种纯度。 我国棉花CMS 研究与利用起步较晚，仍有较多问题有待解决，但可以借鉴水稻、油菜、白菜和萝卜等作物中CMS 研究与利用的成功经验， 加强对现有 “三系” 材料CMS-D2 胞质效应产生的分子基础研究，采取常规育种、MAS 育种和细胞工程育种等相结合的方法选育和改良强优势的“三系”亲本和杂交种，并辅以适宜的栽培技术措施等尽量减轻甚至消除不育细胞质带来的负效应，从而拓宽胞质不育“三系” 杂交种在我国夏季温度较高的长江流域棉区的推广种植。 近年来，已有一些强优势的棉花“三系”杂交种如邯杂301、优质棉中棉所99 和鲁杂2138 等在黄河流域棉区和新疆植棉区示范种植，表现出显著的增产潜力和适应性，说明不育系简化制种技术在我国未来杂交棉生产中具有广阔的应用前景。 因此，选育和改良棉花“三系”杂交种并在我国主产棉区推广应用，有望大幅度增加植棉效益并提高棉农的收入。