骨组织工程及选择性细胞滞留技术的研究进展

杨钱冬 周江玲 杨明 熊翱 侯天勇

骨组织工程中骨移植材料的成骨活性是影响骨组织工程移植成功与否的关键。已有研究证实，骨髓富含多种骨祖细胞、细胞因子和生长因子[1]。这些成分是促进成骨的生物活性成分的重要天然储存库，然而其只在骨髓抽吸物(bone marrow aspiration，BMA) 中占很小部分，这导致了传统的将移植物简单浸泡于骨髓溶液中或直接将骨髓注射至移植区的情况不能达到较高的局部有效浓度[2]。因此，基于高效骨髓利用的骨髓富集骨修复技术应运而生，其核心理念是将自体骨髓中具有促成骨作用的细胞和细胞因子浓聚于支架材料，快速构建成具有高成骨活性的骨移植材料。国内外已有该技术应用于骨修复的临床报道：Gan等[3]设计并使用了密度梯度离心技术，旨在提升 BMA 内有效成分的浓度，尽管在过去的十几年里这一技术被不断改进，但它仍然有着需要相对较多的骨髓抽吸物，以及特定的复杂的设备等一系列问题[4]。因此，亟须找到一种替代的更简便、高效的骨髓富集方法。2002 年，Muschler等[5]提出了另一种提升 BMA 中有效成分浓度的方法，称为选择性细胞滞留 (selective cell retention，SCR) 技术，有着操作简单，不需要任何昂贵的设备及严格的操作条件等优点[6]。笔者将围绕骨组织工程的基本概念及 SCR 技术的研究进展等进行综述。

一、骨组织工程概述

骨组织是由有机成分和无机成分构成的复合体，其主要功能是运动、支持和保护身体，同时也是重要的造血和免疫器官[7]。有机成分主要由 Ⅰ 型胶原组成 (约占 30%)，无机成分主要是以羟基磷灰石 (hydroxyapatite，HAP) 形式存在的磷酸钙 (约占 70%)[8]。

骨组织工程技术的基本原理是通过模拟体内骨组织生长过程来治疗骨缺损[9-11]。骨组织工程中的三大要素包括：支架材料、种子细胞以及组织工程技术中所需要的细胞因子[12]。其中理想的骨组织工程中的移植物材料应具备的基本特征包括：骨整合 (osteointegration)，骨诱导(osteoinduction)，骨传导 (osteoconduction)[13-14]。骨整合的定义为植入物和骨骼之间可以形成直接接触的界面，没有软组织在之间形成阻挡，即能达到功能与结构的直接整合。骨诱导是骨愈合过程中的一种现象，指材料具有刺激未成熟细胞发育成成骨细胞的作用。骨传导性指移植物能为血管的长入和新骨的形成提供一个支架，主要依赖于所使用的生物材料及其形态[15]。目前已有研究报道的除自体骨以外的移植材料主要有以下几类：天然及人工高分子聚合物[16]、金属[17]、生物陶瓷[18]、水凝胶[19]等。目前在临床上应用最为广泛的是脱钙骨基质 (decalcified bone matrix，DBM)，它通常是由异体骨组织脱脂、脱蛋白、脱钙后获得的，具有良好的骨诱导性和骨传导性，可加速骨形成，促进骨愈合[20]。但其成骨效能仍劣于金标准自体骨。因而骨组织工程中的种子细胞[21][如细胞分化能力极强的间充质干细胞 (mesenchymal stem cell，MSC)，在人体骨髓中含量较为丰富，有研究证实体外大量培养和保存对其分化能力无影响，取材方面通过骨穿便可得到，因而被当作最有潜力的种子细胞] 和细胞因子[21-23](一种或一类对于细胞具有复杂调控机制作用的细胞因子，尽管目前关于成骨的全部信号通路尚未明确，但广大学者已经掌握了大部分与成骨相关的细胞因子，并了解了其作用机制，证实了其效果) 是决定移植物成骨能力的关键因素。

骨组织工程中骨髓富集的理念，可以将促进成骨的种子细胞和细胞因子有效地富集到支架材料上，既完成了骨组织工程技术三大要素的综合，又可显著提高骨组织工程的成骨能力，是近年来研究的热点。

二、SCR 技术的原理及应用

随着干细胞治疗理念的研究进展及其在组织工程领域的应用，目前有希望通过干细胞技术以制造理想的骨组织工程移植物用以促进骨愈合。目前，这类技术的原理通常是通过将骨髓 MSC 植入到适合细胞附着、增殖和分化的骨组织工程生物支架上来构建。包括实验和临床研究在内的越来越多的证据表明，骨髓是促进成骨的生物活性成分的重要天然储存库，但传统的骨髓富集策略是将移植物简单浸泡于骨髓溶液中或直接将骨髓注射至移植区，这种情况不能达到较高的局部浓度[2]。因而在 2002 年，Muschler等[5]提出了 SCR 技术，用于解决骨髓富集面临的各种困难，本部分将对 SCR 技术的原理、应用等方面进行阐述。

1.SCR 技术原理：SCR 技术主要的原理是物理拦截的孔径效应，细胞 (特别是有核的细胞) 附着在基质上的液体自由通过时，通过适当地减小支架的孔径，可达到将更多的骨髓中具有增殖和分化潜能的祖细胞、细胞因子和生长因子保留在支架上的目的[18]。Hernigou 等[24-25]的研究已经证实，SCR 技术能使富集的复合材料具有相对较高的细胞成分和生长因子的浓度。其富集的细胞包括骨髓 MSCs、多种核细胞 (karyocytes)、内皮祖细胞 (endothelial progenitor cells，EPCs)、单核细胞 (monocytes) 等，并增加了骨组织工程材料中局部所含的细胞因子的浓度，包括骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMPs)、血小板源性生长因子 (platelet-derived growth factor，PDGF)、血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF) 等。

2.SCR 技术的操作流程：在 SCR 技术的临床研究中，骨髓采集的优选部位是髂骨[26]，备选部位是椎体和肱骨近端[27]，且一般单一穿刺点抽吸的骨髓量不应超过2 ml。而对于 SCR 技术的设备而言，目前市面上存在手动款 (Cellect DBM System) 及电动款 (Screen-enrich-combine Circulating System)[28-30]。尚无研究比较两种类型设备的优缺点，它们在已有的研究中都具有较好的富集结果。共同的操作流程是，在骨髓采集完毕后，利用负压抽吸的原理，通过手动按压或电动富集器，弹簧牵拉后回弹形成负压抽吸，在放置异体骨或人工骨等骨组织工程修复材料的容器内形成负压，使患者的骨髓可以在负压的作用下滤过骨组织工程修复材料，多次循环增加骨髓与骨组织工程修复材料的接触，以提高骨移植材料的生物活性，促进患者骨骼重建，赋予传统骨组织工程修复材料新的生物活力。目前对于最佳的循环次数，尚无研究报道，不同的仪器和富集材料间可能存在差异。

3.SCR 技术在临床上的应用：SCR 技术可选择的移植物材料包括 DBM、辐照同种异体骨 (irradiated allograft bone，IAB)、胶原纤维、明胶海绵和磷酸三钙 (tricalcium phosphate，TCP) 等[31-33]。临床上许多研究已经证实了SCR 这一技术的可行性：Lee 等[34]通过 SCR 技术富集BMA，联合减压清创术治疗了继发性股骨头坏死，在术后2 年内 3 例患者都有良好的结果。Yousef 等[32]同样利用SCR 技术，并联合运用胶原蛋白支架，用于脊柱融合术，治疗了 21 例患者，并在平均 7 年的中长期随访里，取得了良好的临床疗效。同样，Yang 等[30]也在 18 例青少年特发性脊柱侧凸患者中使用了 SCR 技术，并取得了满意的临床随访结果。此外，也有研究比较了使用传统骨移植材料和使用 SCR 技术治疗骨缺损的结果，Shen 等[35]的研究发现了 SCR 组的骨愈合时间短于传统移植物愈合组，证明了 SCR 技术的临床效果。

4.SCR 技术的潜在风险：SCR 技术作为干细胞治疗的一种形式，是否存在风险以及是否符合伦理要求是学者们普遍关注的问题。目前有两项关于 SCR 技术的回顾性临床研究报道，共有 3 例患者出现术后感染，但尚不清楚是否是移植物植入或其它原因导致[30,36]。而 Long 等[37]报道的 775 例骨髓抽吸操作的并发症发生率为 0.3%，并且在纳入的 SCR 技术研究中，未报告相关的不良事件，再次证实了该技术的安全性。

三、SCR 技术的最新研究进展

基于 SCR 技术的尺寸效应的原理，还可以通过一系列物理、化学的方法来调整支架的生物理化性质，进一步提高 SCR 技术富集的效率。Hou 等[38]使用纳米级的自组装肽 (self-assembling peptide，SAP) RADA16-I 修饰了 DBM 支架，发现支架的孔径从约 396.24 μm 减少到20.22 μm，极大地提高了 SCR 技术的物理拦截效率 (孔径效应)，提高了骨髓富集的效率。此外，RADA16-I 可以提供一个更适合成骨的细胞微环境，促进 DBM 与细胞的相互作用，调节细胞功能，进一步促进 DBM 支架的成骨。该文还提出，经上述方法修饰后富集效率更高的原因可能还与电荷相互作用有关，因为骨髓中的细胞和因子通常具有不同的电荷，也可以根据这一原理来提高富集效率(电荷效应)，Luo 等[39]则用赖氨酸环 RGD (lysine-cyclic RGD，LcRGD) 肽修饰 DBM，除了能够使 SCR 技术富集后的材料保留较高浓度和数量的 MSCs，该复合材料同样提供了一个有利于成骨诱导的微环境。但是孔径拦截和电荷吸附的原理都不能用于选择特定类型的细胞进行富集，若能在支架材料上增加特异性受体和配体之间特异性结合(配体效应) 的应用，则可达到骨髓细胞特异性富集的目的。例如，Xing 等[40]采用分层自组装技术 (layer-by-layer self-assembly technique，LBL) 对 DBM 支架进行修饰，构建了一种新型复合材料，这种材料运用了物理拦截和化学识别结合的原理，显著提高了 SCR 的效率和特异性，同样提供了一个有利于骨组织生长的微环境，可以明显促进骨髓 MSC 的迁移、增殖和成骨分化，从而加速骨修复。并且，这种新型的生物材料具有成本低廉、运输方便、可在术中快速构建等优点。Tang 等[41]设计了一个包含层胶粘连蛋白 α4 的核心功能氨基酸序列的胶原结合域对 DBM进行修饰，以增强骨组织工程支架的功能，使得支架上具有了能与 MSCs 等层粘连蛋白受体相结合的生物活性配体。这种功能化的支架结合 SCR 技术，提供了一个具有更好生物相容性、细胞黏附、成骨诱导和血管生成的微环境，可以进一步促进骨的形成和血管化。

综上，传统的 SCR 理念，是通过调节支架材料网孔的大小来实现对 BMA 中有效成骨成分的富集，这种情况的富集成分易聚焦在材料的表层，深部效率较低。未来SCR 技术研究的热点应聚焦于选择性的富集，以达到骨髓成分的定向定位富集，进一步实现临床转化前的 SCR 基础理论储备。

四、总结

笔者综述了骨组织工程概况和 SCR 技术的原理及应用情况，证实了 SCR 技术能通过富集植入物材料上的骨髓中的有效成分的浓度，达到促进骨组织愈合的目的，有着良好的应用前景。虽然 SCR 技术已在临床上广泛应用，但仍存在着一些问题，例如，在已有的实验研究中，在对支架材料进行修饰重组的过程中添加了一系列化学物质，虽然实验证实其提高了富集的效率，但由于伦理问题尚不能直接应用于临床，且目前应用 SCR 技术产生最佳治疗效果的 MSC 的数量或浓度目前尚无明确标准。在未来，需要对 SCR 技术进行更深入的机制研究以及更长期的临床应用疗效评估，以实现全面化和标准化的 SCR 的移植物制备和应用方案。