浅析细胞自噬在溃疡性结肠炎发病机制中的作用

时艺榕,郝微微,张尔馨,王珠环,李 乐

时艺榕,郝微微,张尔馨,王珠环,李乐,上海中医药大学附属曙光医院 上海市 200120

0 引言

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因和发病机制尚不十分明确的反复发作的慢性非特异性炎症性肠病,以粘膜炎症为特征,病变主要限于大肠黏膜与黏膜下层,呈连续性弥漫性分布.多从直肠开始,逆行向近端扩展,可累及全结肠甚至末端回肠.临床起病多缓慢,少数急骤偶有暴发.病程多迁延,呈发作与缓解期交替,少数可持续并逐渐加重.以反复发作的腹泻、腹痛、粘液脓血便等为临床特征[1,2].

UC的发病机制复杂,尚未形成统一的共识.普遍认为疾病的发作是由于扰乱粘膜屏障、改变肠道微生物群的健康平衡和异常刺激肠道免疫反应的事件触发的,和遗传易感、环境、免疫、微生物组和肠道菌群等密切相关[3].现代科学家不断深入研究,探索UC的发病机制,发现细胞自噬功能障碍与肠道异常炎症有关[4],还会引起肠上皮细胞损伤,调控自噬可以改善肠粘膜的功能;而溃疡性结肠炎便是以粘膜炎症为特征,因此细胞自噬与溃疡性结肠炎的联系值得研究.本篇综述旨在浅析细胞自噬在溃疡性结肠炎发病机制中的作用,为进一步阐释UC的发病机制提供新的思路.

1 细胞自噬概述

1.1 细胞自噬概念 自噬是指细胞内成分被输送到溶酶体室进行降解和再循环的复合分子途径.细胞自噬是细胞组分降解与再利用的重要机制.自噬有三种形式: 微自噬、伴侣介导的自噬和大自噬.微自噬是溶酶体膜延伸内陷细胞内容物的降解过程.伴侣介导的自噬需要蛋白质中的KFERQ序列进行降解,具有这种序列的蛋白质被一种伴侣蛋白HSC70识别,将它们带到溶酶体膜上,被膜受体转运到溶酶体中,并在溶酶体腔内降解[5].大自噬是一种选择性的大细胞自噬,需要特殊的结构自噬体以包埋细胞内容物和靶向蛋白质.自噬体与溶酶体融合,并将其内容物输送到腔内降解.其机制通常包括自噬体的生长发育、与溶酶体的融合以及最终的降解等一系列事件[6].在这三种类型中,大自噬是细胞清除受损细胞器和其他相关碎片的主要或普遍的途径,因此细胞自噬通常指的是大自噬[7].细胞自噬需要自噬(小)体和多种自噬相关的蛋白等参与和介导,和自噬相关的基因亦有关系.

1.2 细胞自噬对维持肠道正常功能发挥作用 肠道的第一道防线是由单层上皮细胞赋予的,肠道上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)和紧密连接复合物是构成肠上皮屏障的主要组成物,IEC还建立了粘膜屏障[8,9].肠上皮屏障是保护肠道微生物群稳态和最小化肠道炎症反应的重要防线[10],细胞自噬在保护上皮屏障功能方面起着一定的作用[11],其可以通过调节细胞因子来诱导IEC程序性死亡,限制肠道炎症[12];自噬调节细胞应激和保护细胞免受应激诱导的凋亡是自噬在IEC死亡中发挥作用的另一个方面[13].缺陷的细胞自噬可能导致IEC过度死亡,而防止细胞死亡对维持功能性的肠上皮屏障是至关重要的[11].肠道对细菌毒素和病原体的防御是由紧密连接蛋白控制的[14],自噬介导的调节紧密连接蛋白正常功能有助于维持肠道屏障作用[13].紧密连接蛋白的破坏会导致肠道通透性增加,有研究表明细胞自噬可通过诱导紧密连接蛋白降解降低肠上皮紧密连接通透性,从而维持肠道功能[9].

细胞自噬和肠道菌群之间存在相互作用的关系,细胞自噬功能失调与肠道菌群失调有关.自噬通过限制侵入性病原体从肠腔向肠外部位的传播抑制其在肠道微生物群中的持久性[15].有实验发现自噬缺乏的小鼠肠道菌群失调,微生物群组成改变,多样性降低,控制炎症反应的菌群数量减少;粪便微生物群组成改变,细菌总数增加,促炎细菌群富集[16].覆盖在肠道上皮、由高度糖基化蛋白(粘蛋白)组成的粘液层是限制腔内微生物与上皮接触的重要物理屏障[17],在维持宿主与肠道微生物的共生关系中起着关键作用[18].粘液通过杯状细胞分泌到肠腔,而自噬可调节杯状细胞的分泌功能从而维持肠道菌群的稳态.Yeom等[19]认为: 肠道菌群中的部分有益菌可刺激细胞自噬促进杯状细胞的粘蛋白生成.自噬和自噬相关蛋白亦可通过调节肠细胞、免疫细胞等释放一些抗菌化合物到肠腔影响肠道微生物群的组成等[20].

细胞自噬在维持肠道免疫稳态中的作用被广泛研究.自噬可调节天然免疫和适应性免疫细胞功能从而影响免疫应答的结果.其可促进免疫细胞如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等,包括非典型免疫细胞,如上皮细胞、内皮细胞和间充质细胞参与固有免疫应答[21].亦可通过调节CD4+T细胞、CD8+T细胞、调节性T(Treg)细胞、Th17细胞等多种T细胞诱导适应性免疫应答并使之处于平衡,保护肠道免受侵袭[13].细胞自噬还可通过破坏免疫突触的稳定性负向调节适应性免疫反应[22].Sun等[23]发现细胞自噬具有介导触发和调节先天免疫和适应性免疫应答的关键功能,如抗原提呈、细胞因子分泌和抗菌肽产生等.

正常状态下,细胞自噬在维持肠道稳态、调节肠道微生物群与天然免疫和适应性免疫的相互作用以及宿主防御肠道病原体等方面发挥重要作用[24].因此,细胞自噬功能失调可能会引起肠道稳态的失衡和功能障碍等,从而导致肠道疾病的发生.

2 细胞自噬在溃疡性结肠炎发病机制中的作用

大量研究表明细胞自噬的缺乏与UC的发生发展有着很大的联系,其可通过诱发肠道功能紊乱和肠道炎症导致UC的发生发展[25].机体氧化应激,细胞发生自噬,包括通过激活一系列信号通路,引起信号转导级联反应,分泌促炎因子,发生免疫应答和炎症反应.因此,我们发现UC会出现细胞自噬功能的障碍,与多种蛋白、基因的表达异常,信号通路激活导致过度的免疫和炎症反应等有关.但细胞自噬在UC的发病机制中究竟扮演怎样的角色以及发挥怎样的作用仍值得我们不断深入探索和总结.

2.1 UC和自噬体及参与自噬的蛋白之间的关系 细胞自噬离不开很多蛋白的参与和调节,其最后的过程是自噬体与溶酶体融合后,溶酶体酶降解并回收包裹的物质[26].其中自噬体的形成以分层的方式涉及一组自噬相关蛋白(autophagy-related proteins,ATG).ATG参与调节自噬的起始以及延伸阶段,为一类自噬组成蛋白.自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)前体分子被蛋白酶ATG4剪去C端的5肽,裂解形成胞浆型LC3(LC3-Ⅰ).ATG9和ATG8的募集促进了吞噬细胞膜的扩张[27],在泛素激活酶ATG7、泛素结合酶ATG3和泛素连接酶复合物ATG5-ATG12-ATG16L作用下,LC3-Ⅰ与膜脂磷脂酰乙醇胺结合而被活化[28],转变为膜型LC3(LC3-Ⅱ).在吞噬细胞中插入LC3-II完成自噬体的伸长和成熟.因此,LC3参与自噬体形成到成熟的全部过程,是自噬过程中最重要的蛋白质分子.同时,ATG12与ATG5的结合对于LC3脂质化和自噬体的形成也是必不可少的.LC3是自噬标志物,通常以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值来判断自噬水平的高低[29,30].邓慧君等发现AGT7在小鼠结肠组织中的表达下降,与临床UC患者血清中ATG7降低的检测结果一致[31,32].

此外,泛素结合蛋白62(sequestosome 1,p62)在自噬体与溶酶体融合后赋予自噬降解的选择性[33].p62作为自噬底物可与泛素化蛋白及LC3-Ⅱ结合,从而参与自噬体形成,而p62本身与异常蛋白质结合可进入溶酶体中降解.因此p62能够反映自噬活性[34].自噬相关因子肌球蛋白样BCL2结合蛋白(myosin-like BCL2 interacting protein,Beclin-1)Beclin-1复合物是自噬途径中最重要的蛋白质复合物之一.ATG14可以通过正调控Beclin-1复合物促进自噬体的产生;该复合体亦可促进自噬小体膜的形成与延伸[35,36].

研究表明UC以参与自噬的蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1表达增加,p62蛋白的表达减少为特征[37],自噬相关蛋白ATG表达以降低为主.当然,参与自噬的蛋白不胜枚举,最具有代表性的就是LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62以及ATG家族.参与自噬的蛋白表达异常会抑制细胞自噬,从而引起UC的发生.

2.2 UC和自噬相关基因的关系 micro RNA(mi RNA)是非编码RNA中的一员,可以从转录后水平影响蛋白的合成.mi RNA在细胞自噬发生过程的不同阶段中起到重要的作用,可通过对下游靶基因表达的调控,参与机体慢性炎症反应[38].SCHAEFER等先使用寡核苷酸微阵列筛选出具有研究意义的自噬基因,再通过qRT-PCR等分析发现mi R-21、mi R-31和mi R-142在UC患者的结肠组织、外周血、唾液中升高[39].曹勇等[40]发现mi R-26a的表达在UC患者组织及血清中明显升高.Xu等[41]研究表明,miR-29a可直接靶向ATG9A抑制细胞自噬,并间接影响Beclin-1、ATG5、ATG16L1的表达,抑制细胞自噬参与UC的调节.

此外,与自噬相关蛋白相对应的自噬相关基因(autophagy-related genes,ATG)亦可调控细胞自噬,其在UC结肠组织的表达中有所改变.Beclin-1基因是哺乳动物中第一个被确认的自噬调控基因,它通过与磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)结合形成复合物,主要在自噬早期阶段的形成中发挥作用[42].陆嘉伟[43]从GEO数据库中挖掘490个UC相关结肠标本,采用加权相关网络分析的方法分析基因与疾病严重性的关系,利用CIBERSORT免疫浸润分析免疫细胞谱与自噬调节基因的相关性,结果发现促自噬的关键基因如ATG5、Beclin-1、LC3等与UC严重程度呈负相关,而且和组织中浸润促炎细胞的浸润呈负相关;抑制自噬的关键基因如雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、丝氨酸/苏氨酸激酶(protein kinase B,AKT)与UC的进展呈正相关.邓慧君等[32]在实验中也发现,葡聚糖硫酸钠盐(dextran sulfate sodium salt,DSS)诱导的UC小鼠结肠组织中自噬相关基因LC3-b、P62以及ATG7均表达下降.为了确定ATG16L1基因多态性在UC 中的作用,Palomino-Morales等[44]研究了425名UC患者以及相匹配对照组的ATG16L1 G等位基因进行Meta分析,表明自噬相关基因ATG16L1变异与UC的发病存在相关性.

2.3 UC中细胞自噬和炎症反应的关系 细胞自噬受上游蛋白激酶mTOR的负调控,mTOR是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,由mTOR复合物1和mTOR复合物2组成.越来越多的证据表明,mTOR复合物1的激活与多种复杂的信号通路有关,包括下游的炎症反应[45,46].核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路是免疫及炎症反应的经典通路;研究发现UC的发生与PI3K/AKT/mTOR、NF-κB等信号通路的过度激活相关[47,48].Cosin-Roger等[45]采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导BALB/c小鼠、人结肠腺癌细胞株Caco-2和HT-29细胞发生实验性结肠炎和氧化应激,结果显示上游Toll样受体4(toll-like receptor4,TLR4)信号通路激活mTOR并抑制自噬,从而使mTOR依赖的自噬下游NF-κB被激活,导致抗炎性细胞因子的产生和氧化应激.此外,在活动性UC患者的大肠组织中进一步证实发生了mTOR磷酸化和自噬相关蛋白的功能异常,TLR4-MYD88-MAPK信号通路和NF-κB通路参与了UC的异常调节.体外和体内研究进一步表明在UC的发病机制中,TLR4-MYD88-MAPK信号转导和NF-κB通路与细胞依赖性自噬的调节异常有关[4,49].Dong等[48]通过LPS诱导的UC细胞模型和DSS诱导的UC小鼠模型发现PI3K/AkT/mTOR信号通路被激活,肠道菌群失调.同时阻断DSS诱导的急性UC小鼠PI3K/AKT/mTOR信号通路激活,结果促进细胞自噬,抑制了炎性细胞因子的分泌,肠上皮屏障功能修复,肠道菌群得到调节,调控了Th17/Treg免疫细胞的平衡[50].腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)是自噬调控的重要因子,亦有实验表明可通过调控AMPK/mTOR信号通路促进UC细胞的自噬,降低UC结肠粘膜的氧化应激[51,52].因此,我们有理由认为细胞自噬的异常使mTOR相关的信号通路过度激活,促进炎症反应,从而导致UC的发生.

NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎性小体是一个多分子复合体,激活后启动促炎细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-18的分裂和分泌.IL-1β通过直接诱导IL-2表达和招募中性粒细胞来增强炎症级联和释放其他促炎细胞因子和趋化因子: 如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-6来加速炎症;而IL-18则促进干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的释放,从而促进Th1细胞的增殖,进一步调节炎症[53,54].UC中NLRP3上游启动信号被刺激,激活NLRP3炎症小体相关通路,从而发生炎症反应.主要的信号通路有TLR4/NFκB/NLRP3通路、mi RNAs/NLRP3通路等[55,56].同时,越来越多的证据表明NLRP3炎性小体和细胞自噬途径通过相互调节联系在一起,自噬途径被抑制可增强NLRP3炎症小体的激活[57,58].正常情况下,细胞自噬可以去除NLRP3炎性小体激活因子,NLRP3炎症小体可被自噬小体吞噬和降解[58],NLRP3的降解也是通过自噬进行的[59].而NLRP3可以与Beclin-1相互作用调节细胞自噬;NLRP3炎症小体的信号通路也可以调节细胞自噬的过程[60].在大量证据的基础上推测UC的发生与细胞自噬的抑制作用,可能与NLRP3炎症小体的信号通路被激活,导致一系列炎症反应有关.

Slit是在免疫系统中表达的糖蛋白[61],Slit可以与环形受体Robo结合以激活Slit/Robo信号[62].Zhou等[63]发现Slit2和Robo1特异性地表达于肠隐窝的LGR5+干细胞中,促进LGR5+干细胞向上皮细胞分化以维持肠道的完整性.Xie研究表明[64]Slit2/Robo1信号参与调节LGR5+干细胞的自噬过程,使促炎性细胞因子过量产生,导致炎症反应,从而影响UC的发生发展等.

很多信号通路通过调控细胞自噬参与了UC的过程,发挥着重要作用.细胞自噬的缺乏会引起一系列信号通路异常,引发炎症反应,从而导致UC的发生.

3 结论

UC是胃肠道难治的慢性炎症性疾病.其特点是复发性和弥漫性黏膜炎症,从直肠开始,持续延伸到结肠近端[65].流行病学研究表明,UC的发病率和患病率在西方国家乃至一些亚洲国家都呈上升趋势,病情迁延难愈[66].临床以腹痛,腹泻,粘液脓血便等为主要表现.现代研究认为遗传易感性、上皮屏障破坏、肠道菌群失调等因素导致的免疫反应紊乱和炎症信号异常等是其发生发展的主要原因,但对UC的确切病因和发病机制尚不清楚[67].其中,细胞自噬逐渐进入科学家的视野,对其研究也越来越多,细胞自噬或将成为治疗UC新的靶点.

本篇综述介绍了细胞自噬在维持肠道稳态、调节肠道微生物群与天然免疫和适应性免疫、宿主防御肠道病原体等方面发挥重要作用,自噬缺乏可激活一系列信号通路,引起信号转导级联反应,分泌促炎因子,发生免疫应答和炎症反应,诱发肠道功能紊乱和肠道炎症导致UC的发生发展,这与参与自噬的蛋白和基因异常密切相关.在探讨UC与自噬和炎症反应的关系时,有大量证据证明UC与炎症有关,自噬抑制会导致炎症反应,从而推断三者之间的联系,但细胞自噬、炎症反应和UC的确切关系值得更深入的研究证实.此外,Slit2/Robo1等信号通路研究不多,有待进一步探索和验证.

当然,细胞自噬只是UC发病机制中的一个因素,每个个体基因的不同、所处环境的差异、生活习惯的区别等使得UC的发生发展是多个因素共同作用的综合结果.一些研究者在参与自噬的信号通路基础上研究治疗UC药物的作用机制,比如基于AMPK/mTOR信号通路探讨白头翁汤、黄柏碱、薯蓣皂甙等对UC的治疗效果[51,52,68],载卡格列净壳聚糖-透明质酸微球通过调节AMPK NF-κB/NLRP3轴治疗UC或将成为一个新模式[69].未来在细胞自噬的基础上研发治疗UC的新药将成为一个新思路.细胞自噬在其他领域如肿瘤、心血管、神经退行性疾病等已成为研究热点,其在炎症性肠病发病机制中的作用也逐渐受到重视,在不影响其他生物过程的情况下严格选择自噬途径或靶点是基于自噬的炎症性肠病治疗策略的关键.未来,还需进一步验证自噬作为炎症性肠病治疗靶点的适用性,并确定其有效性和可行性.