江苏地区H3亚型禽流感的流行病学调查分析

俞新鹏

（沛县农业农村局，江苏沛县 221600）

禽流感是由正黏病毒科A 型流感病毒属的禽流感病毒引起的禽类A 类传染病。该病广泛流行于世界上多个国家和地区，给养禽业和人类带来巨大的威胁和经济损失。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是单股负链、分节段的RNA 病毒，其基因组全长13 kb，含有基因片段8 个，分别编码HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1 和PB2 蛋白［1］，其中血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是比较重要的两个基因节段。根据表面蛋白HA 和NA 的抗原性，可将AIV 分为18 个HA 亚型和11个NA亚型。目前我国常见的AIV主要有H9、H7、H5、H3、H10、H6 亚型等。目前，只有H5 和H7 的部分毒株是高致病性禽流感病毒，其他亚型都是低致病性禽流感病毒。H3 亚型禽流感病毒虽然致病性低，但其感染性和毒力不断增强，危害趋于严重，特别是发生继发感染或混合感染时，危害更大。研究表明，H3 亚型禽流感能跨越种间屏障，感染猪、马、犬、猫等多种哺乳动物，具有很强的宿主适应性［2］。近年来，我国在不同地区和宿主中多次分离到H3亚型禽流感病毒［3］。在全球大多数国家，H3 亚型流感病毒在人流感流行病学监测中显示为优势毒株［4］。因此，有必要加强H3 亚型禽流感的流行病学调查，以对该病进行有效的防控，保障畜禽养殖业安全和人类健康。近期市场反馈，江苏省部分地区蛋鸡养殖场存在鸡群禽流感发病与死亡情况，因此，于2023 年2 月对江苏地区两个疑似发生该病的蛋鸡养殖场开展H3 亚型禽流感的流行病学调查，为掌握江苏地区H3 亚型禽流感的发生及流行情况提供参考。

1 材料与方法

1.1 调查点选择

从江苏省盐城市和南通市各选择一个发病典型的蛋鸡养殖场作为调查点。其中，盐城市养殖品种为海兰褐蛋鸡，存栏量12 000只，蛋鸡在52 日龄开始发病，表现为眼睛流泪、鼻孔潮湿、个别鸡精神不佳、张口呼吸，夜间听鸡有呼吸道症状，每日死亡35只左右，日死亡率0.3%。南通养殖品种为罗曼灰，存栏量15 000 只，蛋鸡在115 日龄开始发病，大群较正常，个别鸡眼睛拉长，精神不佳，咳嗽，夜间听鸡有呼吸道症状，每日死亡30只左右，日死亡率0.2%。对当日死亡的病鸡进行解剖发现，剖检病变主要有气管轻微出血或有黏液，支气管干酪样物堵塞，肺脏淤血、水肿，心冠脂肪出血点等，初步判断为疑似禽流感。

1.2 试验器具

禽流感病毒H5、H7、H9、H3 血凝抑制试验抗原，生理盐水，5 mL 注射器，100 μL 单道移液器，100 μL 8 道移液器，一次性移液器枪头，直径9 cm 玻璃平皿，一次性96 孔V 型板，微量振荡器，离心机，10 mL离心管等。

1.3 试验方法

1.3.1 血清样品制备 在所调查的两个蛋鸡养殖场分别随机采集30份正常鸡群的血液样品。使用一次性注射器从鸡翅根静脉采血，每只鸡2 mL，将血液样品在室温或37 ℃恒温箱中倾斜静置2 h 至收集血清，标记编号，待检。

1.3.2 血凝试验

1）采血。使用5 mL注射器抽取1 mL浓度为3.8%的柠檬酸钠抗凝剂，进行翅根静脉采血。

2）红细胞洗涤。将采集的抗凝血注射到10 mL 离心管，注入生理盐水混匀，放入离心机内配平，3 000 r/min 离心3 min，弃去上清液，重复清洗3 次，所得红细胞沉淀加入生理盐水，放置冰箱内4 ℃冷藏备用。

3）1%红细胞悬液的配制。抽出所需生理盐水，弃去红细胞所占的量，即红细胞与生理盐水比例为1∶100，插入红细胞底部抽取红细胞，与生理盐水混匀，反复吹吸混匀备用。

4）抗原的倍比稀释。在96 孔V 型板标记抗原检测项目：禽流感H5、H7、H9、H3。在其第1—11 孔均加入25 μL 生理盐水，第12孔加入50 μL 生理盐水；对应吸取25 μL 抗原依次加入反应板第1列，之后用100 μL 8道移液器调至25 μL依次进行倍比稀释，即第1列反复吹吸8 次混匀后吸取25 μL 加入第2 列，抽出25 μL 混合样品加入第2 列中，依次稀释至第11 列，从第11 列中吸出25 μL 混合液并弃去，即完成倍比稀释。最后用振荡器振荡20 s充分混匀，在室温25 ℃静置20 min。

5）血凝情况分析。每孔均加入配制好的1%红细胞悬液25 μL，振荡混匀，在25 ℃恒温培养箱中静置25 min。将反应板倾斜45°，观察红细胞悬液有无呈泪滴状流淌，完全血凝（不流淌）孔对应的抗原最高稀释倍数代表1个血凝单位（HAU）。

表1 蛋鸡血清样本的H5、H7、H9、H3抗体滴度

1.3.3 血凝抑制试验

1）采血及红细胞悬液的配置。方法同1.3.2。

2）4 单位抗原的配制与校正。根据抗原稀释倍数=血凝效价/4，前列按1∶4稀释的孔不加抗原，即1块96孔V型板使用4单位抗原2 mL。校正结果判定，从左到右，96 孔V 型板前3 孔为完全血凝，第4、5、6 孔完全沉淀，说明该4单位校正结果成立。

3）待检血清的倍比稀释。将被检血清进行标号，每8 个样品为1 套，在96 孔V 型板上标明场区和检测项目：禽流感H5、H7、H9、H3。第1—11列的孔中加入25 μL生理盐水，每个板第12 列作为阴性对照，加入生理盐水50 μL。将待检血清对应加入每个板的第1列，每孔均加入25 μL，之后按照对抗原的倍比稀释方法完成倍比稀释。

4）抗原加入。向稀释好的血清中加入配制的4单位抗原，每孔加入25 μL，最后一列作为阴性对照，不加，之后用振荡器振荡20 s 充分混匀，在室温25 ℃静置20 min。

5）血凝抑制情况分析。在96 孔V 型板中每孔加入25 μL 的1%红细胞悬液，振荡20 s 充分混匀，在25 ℃恒温培养箱中静置25 min。之后将96 孔V 型板倾斜45°，2 min内进行观察，红细胞悬液凝集孔对应的血清最高稀释倍数为该血清的HI 抗体效价，即抗体滴度；半流的孔不作为分析结果。

2 结果与分析

由表1可知，盐城采样点蛋鸡血清样本的H5、H7、H9 平均抗体滴度分别为6.9、7.0、7.2；南通采样点蛋鸡血清样本的H5、H7、H9平均抗体滴度分别为9.2、9.2、9.0。二者蛋鸡血清样本的H5、H7、H9 抗体水平均较正常。而在未进行疫苗免疫的情况下，两个采样点蛋鸡血清样本的H3 平均抗体滴度分别为4.5、4.3，且变异系数（CV）较大，分别为39.9%、46.8%。结合对病死鸡的临床观察及解剖结果表明，蛋鸡群可能存在H3 亚型禽流感病毒感染。

3 讨论

近年来，H3 亚型禽流感病毒分离率较高，致病力有增强的趋势，危害持久，能长期存在于家禽体内［5-7］。前人研究发现，AIV 与人的H3 流感病毒关系密切［8-9］。另外，H3 亚型禽流感病毒还能与H9N2、H5N1 亚型流感病毒发生基因重组，人源和禽源流感病毒还能通过猪发生基因重排［10］，导致AIV 致病性增强，给禽流感防控带来更大困难。因此，对家禽AIV 进行长期的流行病学监测，密切关注AIV 传播、进化和变异情况，为进一步强化防控H3 亚型禽流感病毒跨种属传播提供充足的数据基础，具有重要的公共卫生学意义。

世界上有8条候鸟迁徙路线，经过我国的主要有3 条路线，分别是西部候鸟迁徙线、中部候鸟迁徙线、东部候鸟迁徙线。此外，野鸟作为禽流感病毒的天然宿主，为流感病毒的变异提供了有利条件。2005 年，我国学者在青海湖分离到的高致病性禽流感病毒，经证实其是由候鸟带入我国［5］。另有研究从广东地区健康鸭体内分离到H3N6 病毒E9 株，怀疑其HA 和NA 基因可能由候鸟迁徙经境外带入我国，且可能是由国外的H3亚型AIV 与H4N6亚型AIV重组而来［6］。2023年2月，江苏省盐城市和南通市两地蛋鸡场鸡群在育成期和开产前出现眼睛流泪、鼻孔潮湿、个别鸡精神不佳、张口呼吸、咳嗽等症状，日死亡率为0.2%～0.3%，对其开展禽流感流行病学调查，经临床症状观察并剖检病变，以及血凝抑制抗体检测等判断，属于H3 亚型低致病性禽流感病毒导致发病。原因可能与东部迁徙路线中的候鸟或与当地野鸟携带病毒等有关。因此，应做好相应的疾病监测与预警，开展综合防控。

4 结论

江苏省盐城市和南通市两个发病蛋鸡养殖场正常鸡群的血清学抗体检测结果显示，该两个蛋鸡养殖场正常鸡群H5、H7、H9 亚型禽流感病毒的平均抗体水平较正常，盐城市正常鸡群的抗体滴度平均值分别为6.9、7.0、7.2，南通市正常鸡群的抗体滴度平均值分别为9.2、9.2、9.0。在无疫苗免疫情况下，两个蛋鸡场正常鸡群的H3 平均抗体滴度分别为4.5、4.3，且变异系数较大，分别为39.9%、46.8%。结合对发病鸡的临床观察及解剖结果表明两个蛋鸡场可能存在H3 亚型禽流感野毒的感染。