响应面法优化超声辅助提取蓝莓多糖工艺研究

韦明杰, 丛 健

(云南华测检测认证有限公司，云南 昆明 650000)

蓝莓（Blueberry）为被子植物门（Magno⁃liophyta），双子叶植物纲（Magnoliopsida），杜鹃花目（Ericales），杜鹃花科（Ericaceae），越橘属（Vaccinium）越橘亚属V. （Vac⁃cinium）。原生于北美洲与东亚，现阶段人工培育蓝莓，果实较大，水分较多，但花青素含量相对偏低。蓝莓是一种具有较强抗氧化性的水果［1］，对衰老、癌症和心脏疾病能发挥其抗氧化作用；此外，蓝莓具有缓解视疲劳、改善视力的功效，并能在一定程度上延缓脑神经衰老，从而增强人体记忆力［2］。研究表明，蓝莓多糖具有强抗氧化性、抗疲劳性、抑制有害菌生长等多种生物活性的功效［3］，因而被应用于各种营养保健饮品中。目前国内已有很多学者将蓝莓多糖提取作为重点研究课题，研究方法多以浸提法为基础，也有将纤维素酶法和超声波辅助法从提取花色苷后的蓝莓残渣中提取多糖［4］的报道，但超声辅助提取蓝莓多糖的报道较少。为蓝莓多糖在食品加工中的应用提供参考，以经高浓度乙醇脱脂的蓝莓为原料，通过响应面法优化超声波辅助提取蓝莓多糖的工艺，选定最优的提取条件组合，以保障提取完全的同时，有效节约资源与成本。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜蓝莓果：于昆明永辉超市海乐世界店购买，采购后至实验室进行清洗、捣碎。

试剂：葡萄糖（AR，500 g/瓶）、苯酚（AR，500 mL/瓶）、无水乙醇（AR，500 mL/瓶，≥99.7%）、水杨酸，购于凯诺商贸有限公司，天津大茂化学试剂厂生产；硫酸（AR，500 mL/瓶，95%～98%），购于凯诺商贸有限公司，西陇化工股份有限公司生产；硫酸亚铁：购于天津科密欧试剂有限公司；DPPH（2，2-联苯基-1-苦基肼基），购于安徽酷尔生物工程有限公司。

仪器：KQ-600VDE 超声清洗机，昆山舒美超声仪器有限公司；UV-2600 紫外分光光度计，日本岛津公司Shimadzu；MS105DU电子天平，瑞士梅特勒公司；N-1300D-WB旋转蒸发仪，日本东京理化器械株式会社北京代表处EYELA；TD5ZLD5-2B 台式离心机，北京京立离心机有限公司；冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蓝莓多糖的提取 取新鲜蓝莓捣碎，用无水乙醇脱脂，将脱脂后的蓝莓渣烘干研粉备用。称取25 g 脱脂蓝莓，放置在加有纯水的超声清洗机中，利用超声波震荡辅助提取，反复提取3次。合并3 次的提取液，并浓缩到100 mL ，随后使用95%乙醇调整至混合液含醇量约80%，4 ℃条件下醇沉，取出后离心，取沉淀物用少量纯水进一步溶解，将溶解物离心过滤，得上清液，浓缩并二次醇沉，醇沉后用冷冻干燥机进行冷冻干燥，最后得到蓝莓粗多糖。

1.2.2 蓝莓多糖含量检测 将葡萄糖浓度（C）和检测吸光度（A）分别作为X/Y 坐标，引入标准曲线方程（A＝10.167C＋0.001 2，R2＝0.999 8）。将上述1.2.1 所得的多糖配制成固定浓度（1.0 mg/mL），依据文献［3］的方法进行检测。将测出的吸光度值A带入回归方程，求多糖含量，以计算多糖提取率［5］。计算公式：

1.2.3 单因素试验

1）料液比。固定提取条件为超声功率60 W 、提取温度60 ℃、提取时间85 min，分析在液料比为1∶5（g/mL，下同）、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 下蓝莓多糖提取率的变化。

2） 提取温度。 固定料液比1∶25（g/mL）、超声功率65 W 、提取时间90 min，分析在提取温度为55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃时蓝莓多糖提取率的变化。

3）提取时间。固定料液比1∶25、超声功率60 W、提取温度85 ℃时，分析提取时间为70 min、75 min、80 min、85 min、90 min 时蓝莓多糖提取率的变化。

4） 提取功率。 固定料液比1∶25（g/mL）、提取时间85 min、提取温度60 ℃，分析提取功率为55 W、60 W、65 W、70 W、75W时蓝莓多糖提取率的变化。

1.2.4 响应面试验设计 在单因素试验基础上做响应面优化设计，固定料液比1∶25（g/mL），以提取温度（A）、提取时间（B）、超声功率（C）为变量因子，设置3 个水平，进行响应面试验，其因素水平表见表1。

表1 超声辅助提取蓝莓多糖的响应面试验因素及水平

1.3 数据处理

运用Origin 2018 对试验数据进行处理和方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同因素对蓝莓多糖提取率的影响

从图1可知，不同料液比、提取温度、提取时间及超声功率下，蓝莓多糖提取率的变化。

图1 不同料液比、提取温度、提取时间及提取功率下的蓝莓多糖提取率

2.1.1 料液比 料液比从1∶5（g/mL）增加至1∶25（g/mL），蓝莓多糖提取率明显提升，并在料液比为1∶25达到峰值，为9.47% ；料液比从1∶25 增加至1∶40（g/mL），随料液比增大，蓝莓多糖的提取率不再有显著变化。考虑到试剂的损耗和提取工作时长，最优选取料液比1∶25（g/mL）进行提取操作。在后续的单因素试验时统一选取料液比1∶25（g/mL）进行试验。

2.1.2 提取温度 蓝莓多糖的提取率随提取温度的升高呈上升趋势，当提取温度为60 ℃时，提取率达到最大值，为10.15% 。继续升高提取温度至65 ℃时，蓝莓多糖的提取率反而略有下降，但总体趋于平稳，考虑能耗和升温时长等因素，提取温度以60 ℃为宜。

2.1.3 提取时间 提取时间75～85 min时，蓝莓多糖的提取率明显提升，并在提取85 min 时达到最大值，为10.46%。但在提取时间超过85 min时，多糖提取率不再提升，长时间提取会造成时间浪费，于工艺优化不利。因此，最佳提取时间选择85 min。

2.1.4 超声功率 超声功率由55 W上升至75 W，蓝莓多糖的提取率随超声功率增大而呈上升趋势，在提取功率60 W 时达最大值，为10.52% 。但超声功率超过60 W，蓝莓多糖的提取率会下降，当功率超过70 W 后，提取率降低明显。因此蓝莓多糖提取的最适宜超声功率为60 W。

2.2 响应面试验优化蓝莓多糖的提取工艺

2.2.1 回归模型的建立与显著性分析 从表2可知不同处理的蓝莓多糖提取率。对表2数据进行拟合分析得线性回归方程模型为：

表2 响应面试验各处理参数及其蓝莓多糖提取率

Y＝10.58+0.20A+0.095B+0.13C－0.040AB+0.17AC－0.025BC－0.25A2－0.14B2－0.53C2

从表3 可知，回归模型F＝37.86，模型P＜0.000 1，回归方程极显著，失拟项F＝0.873 3（F＞0.05）不显著，判定该回归方程是可信的，具备预测试验真实性的能力。模型拟合度为97.99%，可信度超过90%，综上数据可知，该模型用于预估蓝莓多糖提取率具有可行性。单因素温度的P＜0.01，极为显著；F值排序FA＝46.43＞FC＝20.11＞FB＝10.74，因此，各因素对蓝莓提取率的影响依次为A＞C＞B。

表3 响应面回归方程方差及显著性分析

2.2.2 不同因素的交互作用 由图2 可看出，提取时间与提取温度交互作用时，在提取功率60 W 不变时，蓝莓多糖提取率在提取温度升高的条件下随之增大，在提取温度60 ℃、提取时间85 min，响应面图出现一个最高点，即蓝莓多糖提取率达到最大值，这与单因素试验结果一致。在提取时间85 min 不变的条件下，蓝莓多糖提取率随提取温度和提取功率增大而提高，在功率达60 W 时，提取温度在60 ℃等高线上出现极值点，即蓝莓多糖提取率的最大值。60 ℃提取温度基础上继续升高提取温度，蓝莓多糖提取率略显下降，但同一条件下增大提取功率，蓝莓多糖提取率却呈明显下降趋势。当提取温度恒定为60 ℃，提取功率与提取时间的交互作用下，随着提取时间的延长，蓝莓多糖提取率增高，但当提取时间达85 min 后，蓝莓多糖提取率无显著的变化，和单因素试验结果相符，表明提取时间80 min 后延长提取，对蓝莓多糖提取率提升影响不明显，同响应面方差分析结果一致。但蓝莓多糖提取率会随着提取超声功率增大而提高，当超声功率达60 W 时，出现峰值，随后增大超声功率，蓝莓多糖提取率反而明显降低。通过以上分析可知，在料液比1∶25（g/mL）的条件下，提取温度、时间、功率中某两个单因素不改变，提取温度对蓝莓多糖提取率的影响是最大的，其次是提取功率，而提取时间达到一定时间后，对蓝莓多糖提取率影响甚微，方差分析结果也验证了这一结论，进而证明所建模型的可靠性。

图2 不同因素交互作用的响应面

2.2.3 最佳提取条件的确定 验证响应面回归方程，求一次偏导。联立方程，可解出理论最优参数，结合试验情况，将参数调整为整值，得到蓝莓多糖优化提取工艺参数为提取温度60 ℃、超声功率60 W、提取时间85 min。经过3次平行试验，蓝莓多糖平均提取率为10.61%，将该理论参数代入模型，计算出提取率理论值为10.58%。

3 结论

在单因素试验基础上，采用响应面试验对超声辅助提取蓝莓多糖的工艺进行优化，结果表明，超声辅助提取蓝莓多糖的最佳工艺为料液比1∶25（g/mL），提取温度60 ℃、超声功率60 W、提取时间85 min。该工艺条件下，蓝莓多糖的平均提取率实际值为10.61%，与响应面模型计算出的提取率理论值为10.58%进行对比，相差较小，表明建立的回归模型可靠，适用于蓝莓多糖的优化提取。