黔东南小香鸡种群禽白血病、禽网状内皮组织增生症和鸡白痢感染情况检测与分析

王 璇, 张晓可, 李 婷, 赵 宇, 张 涛, 潘 永,王庆红, 章厉劼, 潘淑惠, 金晓峰, 文正常*

（1. 贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005；2. 贵州省兽药饲料检测所，贵州 贵阳 550003）

禽白血病（Avian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（ALV）引起的禽类多种传染性肿瘤疾病统称，自然条件下以淋巴白血病最为常见［1-4］。禽网状内皮组织增生症（Reticulo⁃endotheliosis，RE）是由禽网状内皮组织增生症病毒（REV）引起的鸡、鸭等症状不同的综合征，如免疫抑制、生长抑制综合征（矮小综合征）、慢性淋巴肿瘤等［3，5-6］。鸡白痢（Pullo⁃rum Disease，PD）是由鸡白痢沙门菌（SP）引起的传染性疾病，通常侵害雏鸡，但青年鸡的感染也有所增加，其典型症状为白痢，通常伴随严重的急性败血症［5，7］。AL、RE 和PD 在鸡群中非常普遍，不仅能水平传播，还能垂直传播，其中垂直传播的风险最高。病毒通过遗传学方式感染鸡后垂直传播至下一代，感染鸡的数量会随世代的更替而不断增加，造成的损失也越来越严重。为了解黔东南小香鸡种群AL、RE 和PD 的感染情况，对该鸡群进行上述3种疫病的血清学检测，便于有效预防、净化疫病，更好地保护黔东南小香鸡的种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试鸡 试验鸡群为贵州某种鸡场笼养的2 000 余只296 日龄黔东南小香鸡种群，采样前已按既定免疫程序对鸡群进行免疫，未采用任何AL、RE 和PD 疫苗免疫，且在鸡群中未见该3种疫病的明显发病症状。

1.1.2 试剂 禽白血病抗原检测及禽网状内皮组织增殖症病毒抗体检测ELISA 试剂盒均购于爱德士公司；鸡白痢抗体（PD-Ab）试剂盒（ELISA）购于睿信生物科技有限公司；血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix（0.05 U/µL）DNA 分子量标准、GoldView I 型核酸染色剂等均购于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 从鸡群中随机抽取524只鸡，每只鸡进行翅静脉无菌采血，将采集的全血37 ℃斜面静置2 h，待血清析出后，将血清移至1.5 mL 无菌EP 管中，于−20 ℃保存待检。

1.2.2 ALV-p27 抗原检测 检测使用禽白血病抗原检测试剂盒。判定结果前先确定试验结果是否有效，当试验成立时，按：

S/P＝（样品OD650−阴性对照OD650平均值）/（阳性对照OD650平均值−阴性对照OD650平均值）计算，若S/P≤0.20，判为ALV-p27 抗体阴性；若S/P＞0.20，判为ALV-p27抗体阳性。

1.2.3 REV 抗体检测 按照禽网状内皮组织增殖症病毒抗体检测试剂盒说明书进行操作。判定结果前先确定试验结果是否有效，当试验成立时，计算S/P，计算公式同1.2.2，若S/P≤0.50，判为REV 抗体阴性；若S/P＞0.50，判为REV抗体阳性。

1.2.4 鸡白痢抗体检测 按照鸡白痢抗体（PD-Ab）试剂盒（ELISA）试剂盒说明书进行操作。判定结果前先确定试验结果是否有效，当试验成立时，计算Cut-Off值，阈值＝阴性对照OD 值＋0.25，若样本OD 值大于阈值，判为SP抗体阳性，反之，判为阴性。

1.2.5 ALV 的PCR 鉴定 参照参考文献［8-10］合成禽白血病引物（表1），引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。抽取ALV-p27 抗原检测阳性鸡只的血液样本，按照血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒说明书提取DNA 为模板，用ALV-A、ALV-B、ALV-J引物进行PCR鉴定。

表1 引物信息

1）ALV-A 与ALV-B 的PCR 反应体系为25 μL：2×Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，灭菌去离子水8.5 μL。反应条件：94 ℃3 min；94 ℃45 s，56 ℃45 s，72 ℃45 s，35个循环；72 ℃10 min。

2）ALV-J 的PCR 反应体系为50 µL：2×Taq PCR MasterMix 25 µL，上、下游引物各2 µL，DNA 模板2 µL，用双蒸水补足至50 µL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

3）PCR 产物保存于4 ℃。产物检测：在10 g/L 的琼脂糖凝胶中加扩增产物6 µL，电流40～60 mA，电压90 V，电泳25 min 左右，然后在凝胶成像仪下观察。

2 结果与分析

2.1 AL、RE和PD感染的检测结果

对鸡群524 份血清进行AL、RE 和PD 的单一感染和混合感染检测，由表2 可知，检测未见三重感染的情况；二重感染以AL+RE情况较为显著，阳性率达12.98%，AL+PD情况次之，阳性率为1.34%，未见有RE+PD的二重感染情况；单一感染以AL 最为严重，阳性率达85.88%，RE 感染次之，阳性率为25.57%，PD感染较轻，阳性率为3.82%。

表2 鸡群AL、RE和PD单一感染和混合感染的检测结果

2.2 ALV的PCR鉴定结果

用ALV-A、ALV-B、ALV-J 引物对ALV-p27 抗原检测阳性的450 份血液样本DNA 进行PCR 鉴定，结果扩增出192 份与ALV-J 大小相近的阳性条带（图1），而未扩增出与ALV-A、ALV-B 相对应的阳性条带，经测序比对为ALV-J 的核酸序列。结果表明，该场黔东南小香鸡种群感染的是J 亚群禽白血病，ALV-J阳性率为42.67%。

图1 部分ALV-J的PCR扩增产物

3 讨论与结论

ALV 感染可分为内源性和外源性两种，前者通常会被遗传到下一代，但不会形成感染型病毒颗粒，也无致病性；而后者会在鸡的基因组中形成感染性的病毒颗粒，具有较强的致病性，并且可通过垂直或水平的方式传播［11］。通过选用禽白血病p27 抗原ELISA试剂盒对黔东南小香鸡种群开展禽白血病抗原检测，发现样品p27 抗原阳性率为85.88%。由于ALV 衣壳蛋白p27 抗原为群特异性抗原，其检测结果只表明鸡体处于病毒感染状态，但不排除内源性ALV 存在感染干扰的可能。外源性禽ALV-A、B、J 亚群PCR 结果显示，ALV-J 阳性率42.67%，ALV-A 和ALV-B 亚群未检出，表明黔东南小香鸡种群外源性禽白血病感染主要为ALV-J亚群。鉴于目前尚无有效的疫苗和药物防治AL 发生，建议尽早对种群采取净化措施，以避免AL进一步发生及流行。

AL、RE 和PD 都可通过遗传学方式在感染鸡之后垂直传播到下一代，感染鸡的数量会随世代的更替而不断增加，从而加剧危害。检测结果显示，未见RE+PD 的二重感染和三重感染情况，二重感染以AL+RE 情况较为显著，阳性率达12.98%。有研究资料显示，AL 和RE 都会导致鸡体致瘤及免疫系统的紊乱。ALV 与REV 能共同阻碍机体产生抗体，影响中枢免疫器官的发育，导致体重的升高，促进肿瘤的形成，引起肿瘤谱的扩展，以及更严峻的免疫抑制等［12］。为保障鸡群的健康，建议定期监测种鸡场的该3 种疫病，在必要情况下及时淘汰阳性鸡只，有效防止疫病的垂直传播，并增强鸡群的抗病力，从而减少疫病的暴发。