基于网络药理学的二仙汤“异病同治”乳腺增生和围绝经期综合征的作用机制

迟皓南，孙小慧，杨 毅△

1 山东中医药大学中医学院，山东 济南 250014；2 山东中医药大学附属医院乳腺甲状腺外科，山东 济南 250011

乳腺增生（hyperplasia of mammary glands，HMG）是一种由于乳腺组织不断增生与复旧导致的良性病变，好发于中青年女性，临床常表现为乳房疼痛，反复发作，易形成乳房肿块［1-2］。目前治疗HMG 的方法多样，如中西医结合治疗、物理治疗等［3-5］，但治疗效果不一，甚则出现胃肠道不适等不良反应。围绝经期综合征（perimenopausal syndrome，PMS）是由于中老年女性卵巢生理功能减退，性激素分泌紊乱，骨密度降低等原因出现的一类临床症候群，发病风险较高［6］，可伴有潮热盗汗、睡眠障碍、情绪异常等症状，严重者可导致心血管及泌尿系统疾病［7］，影响患者身心健康与生活质量。相关指南指出，激素治疗能够缓解PMS［8］，但部分患者会引发阴道流血等妇科疾病［9］。

二仙汤出自《中医方剂临床手册》，是张伯讷教授创制的一首经验方。该方由仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归、知母、黄柏组成，具有阴阳双补，调理冲任之功。相关研究［10-12］显示，二仙汤治疗HMG与PMS 均在于调节体内雌、孕激素水平及调控信号传导通路异常等，其中仙茅、淫羊藿、巴戟天等单味中药能分泌卵巢颗粒细胞促进雌二醇，进而改善人体内分泌环境。然而二仙汤组方有效成分较多，涉及的靶点通路复杂，具体分子作用机制尚未阐明，且单用传统药理学难以系统分析。因此，本研究运用网络药理学方法，探究二仙汤“异病同治”HMG及PMS的分子机制，为临床治疗提供依据。

1 研究方法

1.1 二仙汤活性成分及靶点筛选运用中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmspsearch.php）进行数据挖掘，以“仙茅”“淫羊藿”“知母”“巴戟天”“当归”“黄柏”为关键词，经过对既往中药有效成分的药物代谢动力学研究结果［13］，根据口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30% 和药物类药性（drug-likeness，DL）≥0.18筛选二仙汤有效活性成分及潜在作用靶点，然后使用Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org），以“人”为属性设定，进行靶点整合和基因规范化处理。

1.2 疾病靶点预测在人类基因数据库（the human gene database，GeneCards）（https：//www.genecards.org）与在线人类孟德尔遗传数据库（online mendelian inheritance in man，OMIM）（http：//omim.org）中输入疾病关键词“hyperplasia of mammary glands”和“perimenopausal syndrome”，剔除重复靶点后，确定乳腺增生和围绝经期综合征的疾病靶点。

1.3 药物与疾病交集靶点预测与构建利用Venn图（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），获得二仙汤中的活性成分与HMG及PMS的重叠靶基因。

1.4 药物-成分-靶点-疾病网络构建将二仙汤中活性成分、药物与疾病的交集靶点导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，其中节点代表药物、成分、疾病及靶点，边代表药物、成分、靶点、疾病间的相互作用关系。

1.5 PPl 及核心靶点网络构建利用STRING（http：//string-db.org/）数据库构建药物与疾病的交集靶点PPI网络；借助Cytoscape 3.7.2软件，以≥Degree 平均值筛选二仙汤治疗HMG 和PMS的核心靶点。

1.6 GO功能和KEGG通路富集分析利用核心靶基因导入基因功能注释数据库（the database for annotation visualization and integrated discovery，DAVID）对药物与疾病的交集靶点进行基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，以P＜0.05 为筛选标准，分别选取前10 条GO 功能及KEGG 通路，制成柱状图进行可视化分析。

2 结果

2.1 二仙汤活性成分及靶点预测共得到二仙汤有效活性成分104 个，其中仙茅7 个，淫羊藿23个，知母15个，巴戟天20个，当归2个，黄柏37个，删除重复活性成分得到二仙汤活性成分对应靶点147个。见表1。

表1 二仙汤活性成分基本信息

2.2 HMG 与PMS 靶点预测在GeneCards 和OMIM疾病数据库以“hyperplasia of mammary glands”和“perimenopausal syndrome”为关键词检索，得到疾病靶点HMG 4153 个、PMS 155 个。将二仙汤靶点与两种疾病靶点进行映射，得到二仙汤“异病同治”HMG和PMS的29个靶点。见图1。

图1 二仙汤与乳腺增生和围绝经期综合征Venn图

2.3 “药物-成分-靶点-疾病”网络构建通过Cytoscape 3.7.2 软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图。该网络图中蓝色节点代表二仙汤中药物名称，红色节点代表疾病名称，黄色节点代表药物活性成分，绿色节点代表靶点。其中，β-谷甾醇（MOL000358）、豆甾醇（MOL000449）、槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）等节点的自由度分别为198、176、170、106，提示以上活性成分可能是二仙汤治疗HMG 和PMS 的关键活性成分。见图2。

2.4 PPl网络构建将二仙汤与HMG和PMS的交集靶点导入STRING在线数据库平台，设置属性为“人”，构建靶点间的蛋白互作关系图，图中共有29 个节点，174 条边，平均节点值为12。利用Cytoscape 3.7.2 软件，以Degree 值≥12 为筛选标准，其中IL-6、VEGFA、TNF、TP53、ESR1、CAT、IL-1β等靶点的自由度较高，说明以上靶点可能是二仙汤作用于HMG和PMS的核心靶点。见图3。

图3 二仙汤治疗HMG与PMS的PPI网络

2.5 交集靶点的GO功能与KEGG代谢通路富集分析共筛选得到生物过程（biological process，BP）121条，主要涉及DNA模板转录正调控、基因表达的正调控、缺氧反应等生物过程；细胞组分（cellular component，CC）15 条，主要涉及胞外间隙、胞外区、质膜等；分子功能（molecular function，MF）26 条，主要涉及类固醇结合、酶结合、类固醇激素受体活性等分子功能。分别选取前10 条制成柱状图。通过筛选得到KEGG 通路20条，主要涉及TNF信号通路、NOD样受体信号通路、HIF-1 信号通路、癌症信号通路、PI3K-Akt 信号通路等。见图4—5。

图4 GO功能富集分析

图5 KEGG富集分析

3 讨论

运用网络药理学方法探讨二仙汤“异病同治”HMG 和PMS 的分子机制，二仙汤“异病同治”HMG 和PMS的活性化合物104个，预测得到靶点147个。

通过“药物-成分-靶点-疾病”网络可以看出，β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山柰酚等活性成分可能是二仙汤治疗HMG 和PMS 的关键活性成分。研究显示，β-谷甾醇可以通过诱导ERα和Erβ两种受体发挥雌激素样作用［14］，改善机体内分泌环境，其中Erα和Erβ受体可促进和抑制乳腺组织增殖［10］，二者作用协同保护乳腺组织。此外，β-谷甾醇还能通过刺激卵巢颗粒细胞分泌雌二醇［15］，进而增强成骨作用及抑制破骨作用，提高骨密度［16］，改善PMS。槲皮素作为天然黄酮类中的一员，具有与雌激素相似的化学结构，可发挥雌激素样作用［17］，同时也可调节雌激素代谢途径，直接调节乳腺癌T47D-β细胞的Erβ受体表达，影响ERα/ERβ比值，抑制细胞异常增殖［18］，防止乳腺组织癌变。研究发现，槲皮素能通过改善雌激素水平进而修复卵巢功能，促进卵泡发育与颗粒细胞增殖，增加雌激素分泌［19］，从而缓解PMS 症状。二仙汤中的活性成分可通过发挥雌激素样作用与调控雌激素代谢从而达到“异病同治”HMG和PMS的目的。

通过STRING在线数据库平台分析得出，IL-6、VEGFA、TNF、TP53、ESR1、CAT、IL-1β等靶点可能为二仙汤治疗HMG 和PMS 的关键靶点。IL-6 作为细胞因子家族的核心成员，在机体免疫、炎症、细胞生成等方面起重要作用［20-22］。其中，在正常乳腺组织中，IL-6 通过与IL-6R 结合激活IL-6/STAT3信号通路，并通过与细胞核中相对应的靶基因发挥作用，调节芳香酶活性，促进雌二醇表达［23］，调节机体内分泌环境，在防治HMG 方面起重要作用。同时，TNF、IL-6 等炎症细胞因子可抑制成骨细胞活性，增加破骨细胞活性［24］，因此抑制炎症因子的激活可以减少骨质流失，改善由PMS 导致的骨密度降低，降低骨折风险。VEGFA 是VEGF 家族中的一员，在血管生成过程中，该基因是对内皮细胞有特异性的唯一因子，参与了多种生理及病理过程的血管生成［25-26］。围绝经期女性体内激素水平变化与细胞凋亡关系密切，该阶段女性体内卵巢粒细胞凋亡导致卵泡停止发育，雌激素减少。研究发现，VEGFA 高表达参与了卵泡发育等生殖过程［27］，可产生雌激素。同时，雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）可与槲皮素结合发挥雌激素样保护作用，影响PMS 的发展进程，提示二仙汤可通过多靶点“异病同治”HMG和PMS。

GO 富集分析发现二仙汤治疗HMG 和PMS 的生物过程主要涉及DNA 模板转录正调控、基因表达的正调控、缺氧反应、生物合成过程的正向调节、类固醇结合、酶结合、类固醇激素受体活性等。KEGG通路富集分析发现靶基因主要富集在TNF信号通路、NOD 样体信号通路、HIF-1 信号通路、癌症信号通路、PI3K-Akt 信号通路等信号通路上，说明二仙汤主要通过调控信号通路参与治疗HMG 和PMS。研究表明，PI3K-Akt信号通路通过影响其下游靶蛋白而促进乳腺细胞增殖及抑制凋亡等［28］，同时也参与骨形成和骨重建过程［29-30］。PI3K-Akt 可通过ErbB 信号通路激活，促进神经干细胞分化，防治神经系统疾病［31］，缓解由PMS 造成的睡眠障碍、情绪失常等症状。研究发现［32］，HIF-1 通路参与绝经后骨质疏松的病理演变，抑制HIF-1 可改善绝经后骨质疏松严重程度。HIF-1 信号通路对缺氧导致的血管生成发挥重要作用［33］，可增强乳腺组织抗氧化能力，提高机体免疫功能，改善增生病理组织，具有抗乳腺增生作用。因此，二仙汤中的活性成分可能通过PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路等参与治疗HMG和PMS。

综上所述，本研究通过网络药理学方法分析二仙汤“异病同治”HMG和PMS的分子机制，发现有147 种可直接或间接影响HMG 和PMS 的有效成分以及可治疗HMG 和PMS 的29 个核心靶点。推断PI3K-Akt 信号通路、HIF-1 信号通路可能是治疗HMG 和PMS 的关键和主要途径。这些数据可为二仙汤的临床应用及进一步开发提供一定理论依据，但具体机制仍需结合体内实验进一步验证。