基于生/醋大黄的大承气汤对实热壅滞证胎粪性腹膜炎小鼠血清ET、NO和T NF-α的影响*

陆景荣，陆梅元，曾海生，马秀梅，陈 勇，赵凤仙，陈宏夏

1 广西国际壮医医院，广西 南宁 530201； 2 广西壮族自治区食品药品审评查验中心，广西 南宁 530029；3 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000； 4 广西中医药大学，广西 南宁 530200

大承气汤出自《伤寒论·辨阳明病脉证并治》，由大黄、枳实、厚朴和芒硝组成，是泻法的代表方剂［1-3］，具有泻下热结的作用，主治阳明腑实证和里热实证等［4］。目前临床主要用于治疗急腹症、肠梗阻与胃肠道功能障碍等疾病，该方还用于辅助改善脑血管患者意识、有机磷农药急性中毒抢救的辅助治疗等［5-6］。研究表明，大承气汤具有泻下、抑制血清内毒素、抗炎、提高机体免疫力等药理作用［3］。大黄经过不同炮制方法，其化学成分及其药效变化差异较大，甚至产生相反的药效［7］。目前多报道大黄与多味药配伍前后药效变化情况［8-10］，鲜见报道大黄不同炮制品与多味药配伍后的泻下功效的变化。本实验主要研究生、醋大黄炮制品的大承气汤对实热壅滞证胎粪性腹膜炎（faecal peritonitis with excessive heat stagnation，ABP）小鼠血清内毒素（endotoxin，ET）、一氧化氮（nitric oxide，NO）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）含量的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器20110793 型全波长酶标仪［BIOTEKEpoch（美国）］；PRACTUM224-KN SOP型电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；TDL-80-2B型低温离心机（上海安亭科学仪器厂）；ZH-B6 型代谢笼（安徽正华有限公司）；PYX-190H-B 型育温箱（广东科力有限公司）。

1.2 药物与试剂显色基质鲎试剂盒（厦门市鲎试剂试验厂有限公司，批号：160525）；炎性介质TNF-α、NO 测试盒（南京建成生物工程研究所，批号：201706、20170406）；氨苄西林胶囊（联邦制药厂有限公司，批号：20300）；实验用水为纯水。

1.3 药材大黄、枳实、厚朴及芒硝购于广东康美药业有限公司，经广西中医药大学药用植物教研室李斌副教授鉴定，大黄为蓼科植物药用大黄Rheum officinaleBaill.的干燥根和根茎；枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥幼果；厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia officinalisRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮；芒硝为硫酸盐类矿物芒硝族芒硝，主要含十水硫酸钠（Na2SO4·10H2O）。见表1。

表1 药材批号与产地

1.4 动物清洁级昆明种小鼠，体质量（20±2）g，雄性。实验动物质量合格证号：0001757；实验动物生产许可证号：SCXK（桂）2019-0002，均由广西医科大学试验动物中心提供。

1.5 方法

1.5.1 药液提取 按处方比例取厚朴24 g，枳实12 g，大黄生/醋药材粉末各12 g，芒硝9 g，分别精密称定，厚朴与枳实加纯水500 mL，浸泡30 min后，加热煮沸后保持微沸30 min，使用500目滤布过滤，药渣再加纯水500 mL 浸泡30 min，加热煮沸保持微沸30 min，过滤，合并2 次滤液，然后分别加入生/醋大黄粉末，浸泡20 min，加热煮沸，保持微沸20 min，使用500目滤布过滤，药渣加入纯水300 mL，加热煮沸后保持微沸20 min，滤过，合并滤液，趁热加入芒硝，搅拌使溶解，浓缩成浓度为0.3∶1 的药液（含生药0.3 g/mL），置于2～8 ℃冰箱储存备用。同上述制备药液方法，将药液浓缩成浓度为0.5∶1的药液（含生药0.5 g/mL），置于2～8 ℃冰箱储存备用。

1.5.2 ABP 小鼠动物模型建立 参考文献［11］以及结合预实验，随机选取15 只健康小鼠为空白对照组，腹腔注射氯化钠注射液0.5 mL/只。取小鼠粪便6 g，加入100 mL 生理盐水，研磨均匀，静置30 min，取上层混悬液，腹腔注射0.5 mL/只，20 h 后小鼠眼角出现浓稠分泌物、少动、蜷曲蹲伏、腹部鼓胀和大便极干等实热壅滞症状。解剖腹腔可见腹腔内有少量浑浊液体，多数肠管膨胀，肠管充血，部分肠管痉挛，表示造模成功。

1.5.3 分组给药 取体质量为（20±2）g 的健康小鼠105只，雄性，适应性喂养3天后随机分为生大承气汤6、10 g/kg 剂量组，醋大承气汤6、10 g/kg剂量组，空白对照组、模型组、阳性对照组［（氨苄西林20 mL/kg（体质量）、60 mg/mL］，每组15 只。生/醋大承气汤不同剂量组造模成功后灌胃，连续2天，每日1次。阳性对照组灌胃氨节西林1.2 g/kg，容积为20 mL/kg（体质量），连续2 天，每日1 次。空白对照组腹腔注射生理盐水20 mL/kg（体质量），20 h后给予蒸馏水灌胃，连续2天，每日1次。模型组造模成功后灌胃蒸馏水，每日20 mL/kg（体质量），连续2天，每日1次。

1.5.4 血清ET、NO 和TNF-α含量测定 各组小鼠造模成功42 h 后，吸取鲎试剂检测配套的血液抗凝剂于无热源试管中，无菌操作下眼球取血，血液置于无热源试管中，与抗凝剂混匀，至冰水中加盖，低温离心（离心半径10 cm，3000 r/min 离心12 min），精密吸取上清液适量，用ET 检查用水配制成2 倍稀释液储存备用。取2 倍稀释液0.2 mL加入到0.8 mL 样本处理液中，混匀，制成10 倍稀释液备用。将10倍稀释液于68 ℃恒温水浴中加热12 min，将加热后的10倍稀释液水浴冷却后在常温条件下离心半径10 cm，3000 r/min离心12 min，取上清液检测ET、NO和TNF-α，检测步骤见显色基质鲎试剂盒说明书。

1.6 统计学方法采用SPSS 21.0 统计软件分析数据，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，组间多重比较方差齐，采用SNK-q检验，方差不齐用Tanbane's T2 检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ET 标准溶液配制与标准曲线的制作ET 标准曲线溶液及其标准曲线见表2、图1。

图1 ET标准曲线

表2 ET标准曲线溶液

2.2 血清ET 含量与空白对照组比较，生大承气汤10 g/kg 剂量组血清ET 含量差异无统计学意义（P＞0.05），生大承气汤6 g/kg剂量组与醋大承气汤6、10 g/kg 剂量组、模型组和阳性对照组比较ET 含量差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，生大承气汤6、10 g/kg 剂量组、醋大承气汤6、10 g/kg 剂量组血清ET含量差异具有统计学意义（P＜0.01），阳性对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；与生大承气汤10 g/kg剂量组比较，醋大承气汤10 g/kg 剂量组和阳性对照组血清ET含量差异具有统计学意义（P＜0.01）；与阳性对照组比较，生大承气汤6、10 g/kg 剂量组、醋大承气汤10 g/kg 剂量组血清ET 含量差异具有统计学意义（P＜0.01），醋大承气汤6 g/kg 剂量组血清ET含量差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠血清ET、NO及TNF-α含量比较（±s）

表3 各组小鼠血清ET、NO及TNF-α含量比较（±s）

注：与空白对照组比较，**表示P＜0.01；与模型组比较，●●表示P＜0.01；与生大承气汤10 g/kg剂量组比较，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；与阳性对照组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；-表示等体积蒸馏水

TNF-α（pg/mL）4.42±0.75**●●##3.92±0.68**●●##4.57±1.13**●●##4.38±0.99**●●##5.89±0.46**●●△△0.56±0.49●●△△##9.31±0.95**△△##组别生大承气汤组鼠数15醋大承气汤组阳性对照组空白对照组模型组15 15 15 15给药剂量（g/kg）6 10 6 10 1.2--外周血ET（EU/mL）0.32±0.11**●●##0.16±0.08●●##0.39±0.09**●●△#0.32±0.08**●●△△##0.46±0.07**△△0.13±0.04●●△△##0.52±0.10**△△NO（μmol/L）186.21±16.84**●●##285.16±28.31**●●##160.98±16.29**●●△△##267.73±26.56**●●△△##204.12±10.62**●●△△44.06±8.74●●△△##75.08±7.15**△△##

2.3 NO含量与空白对照组比较，生大承气汤6、10 g/kg 剂量组、醋大承气汤6、10 g/kg 剂量组、模型组和阳性对照组血清NO 含量差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，生大承气汤6、10 g/kg 剂量组与醋大承气汤6、10 g/kg 剂量组和阳性对照组血清NO 含量差异具有统计学意义（P＜0.01）；与生大承气汤10 g/kg剂量组比较，醋大承气汤6、10 g/kg 剂量组和阳性对照组血清NO 含量差异具有统计学意义（P＜0.01）；与阳性对照组比较，生大承气汤6、10 g/kg 剂量组、醋大承气汤6、10 g/kg 剂量组血清NO 含量差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

2.4 TNF-α 含量与空白对照组比较，生大承气汤6、10 g/kg 剂量组、醋大承气汤6、10 g/kg 剂量组、模型组和阳性对照组血清TNF-α含量差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，生大承气汤10 g/kg剂量组、醋大承气汤6、10 g/kg 剂量组和阳性对照组血清TNF-α含量差异具有统计学意义（P＜0.01）；与生大承气汤10 g/kg 剂量组比较，阳性对照组血清TNF-α含量差异具有统计学意义（P＜0.01）；醋大承气汤6、10 g/kg 剂量组血清TNF-α含量差异无统计学意义（P＞0.05）；与阳性对照组比较，生大承气汤6、10 g/kg 剂量组、醋大承气汤6、10 g/kg 剂量组血清TNF-α含量差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

3 讨论

相关研究表明，急性感染性疾病和急腹症等多是ET 生物活性的体现，或由其诱导产生的细胞因子与其他炎症介质所致。实热便秘是阳明腑实证的一种，实热便秘的致病因素之一即为ET［12］。TNF 的生成释放是机体对各种外源性或内源性物质刺激的反应，ET 是TNF 释放的物质，ET 和TNF 都会对机体产生损害，两者结合能产生协同作用［12］。肿瘤坏死因子可通过内分泌作用进入血液循环，还可通过旁分泌形式对邻近肠上皮细胞发生影响，从而对肠道屏障功能产生一定影响［13］。NO 具有生物学活性，广泛分布于生物体内各组织中，它是一种新型生物信使分子，其在肠道内导致的多器官功能衰竭综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）发病过程中起关键作用［14］。相关研究［15］表明，NO 是炎症介质网络的最后共同途径，是导致器官功能损害的重要介质，炎症介质引起的全身性炎症反应综合征是MODS 发生的主要机制，在细菌ET 和炎症细胞因子刺激下过度产生的NO 为败血症性休克病理发生过程中的关键中介机制［11］。

本研究表明，生、醋大黄的大承气汤作用于实热壅滞的ABP 小鼠，其血清NO 增加，ET、TNF-α降低，可能与生、醋大黄炮制品及其配伍的厚朴、枳实和芒硝有关，至于与什么成分变化或含量的增减作用有关，有待进一步研究。