基于GC-IMS不同年份黄酒挥发性风味物质分析

沈 棚，薛红玮

（1.上海康诺执信食品有限公司，上海 201703；2.上海营家生物科技有限公司，上海 201703）

黄酒与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒，以玉米、稻米、小麦、黍米等为原料，经过蒸料，拌以米曲、酒药或麦曲，进行糖化和发酵制成[1]。黄酒通常具有色、香、味、格的复杂特征[2]。由于发酵原料[3]、酿造工艺[4]、发酵微生物[5]、贮藏环境[6]以及陈酿时间[7]的不同，黄酒中所形成的风味物质也不尽相同。其中，陈酿是黄酒生产工艺中较为重要的一个环节，陈酿时间也可称为酒龄，是评价黄酒质量的重要指标。黄酒在陈酿过程中会发生大量的物理和化学变化，这些变化对于酒体协调性和稳定性起着关键性作用。目前，针对不同陈酿时间黄酒风味物质的相关研究已逐步展开[8]，利用现代仪器分析技术分析黄酒中的挥发性物质的种类及其含量，有助于了解不同陈酿时间黄酒的香气组成成分及其风味特征[9]。

气相色谱-离子迁移色谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）法是一种快速检测分析待测样品中挥发性物质的技术[10]。该技术无需样品前处理，极大简化了分析过程，可实现快速检测，且其灵敏度更高，检测限更低[11]。近年来被广泛应用于分析酒类、茶叶、香精香料、肉制品、中药等样品中挥发性风味物质[12]。鲜灵芝等[13]使用气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）比较新品糯米杨梅酒与杨梅酒的挥发性物质，结果表明，两种样品组成成分有显著差异，其中，糯米杨梅酒的挥发性物质种类更为丰富；顾双等[14]采用GC-IMS技术建立了一种黄酒标注酒龄及品牌快速鉴别的方法，结果表明，GC-IMS技术在黄酒质量评估等领域有较好的应用前景。虽然GC-IMS技术已广泛运用于食品风味检测，但关于GC-IMS技术分析不同贮藏年份黄酒挥发性风味物质方面的研究鲜有报道。

本研究采用GC-IMS技术对不同年份黄酒中的挥发性风味物质进行分析，构建指纹图谱，并进行主成分分析（principal component analysis，PCA）及聚类分析（cluster analysis，CA），以期为黄酒中挥发性风味物质的鉴别提供科学依据，为不同陈酿年份黄酒的挥发性风味物质研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

分别选取2008、2010、2012、2014、2018、2019年份采用相同工艺分别制作的6个黄酒样品，分别编号为A08、A10、A12、A14、A18、A19：产地为绍兴。

2-辛醇（分析纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

FlavourSpec气相色谱离子迁移谱仪：德国GAS公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

称1mL样品置于20mL顶空瓶，将5μL2-辛醇（500mg/L）作为内标物质加入样品中。在常温下经顶空进样，并采用气相色谱-离子迁移谱仪进行测定，每个样品重复测定3次。

1.3.2 GC-IMS分析

进样条件：采用自动顶空进样，进样体积200 μL，孵育时间15 min，孵育温度60 ℃，进样针温度85 ℃，孵化转速500 r/min。

GC条件：MXT-WAX色谱柱（30 m×0.53 mm，1 μm），分析时间40 min，柱温60 ℃，载气/漂移气为高纯氮气（N2），载气/漂移气条件：初始流速为2 mL/min，维持2 min；8 min内升至10 mL/min，在10 min内升至100 mL/min，维持20 min，总GC运行时长为40 min。

IMS条件：漂移管长度5.3 cm；管内线性电压500 V/cm；漂移管温度45 ℃；IMS温度45 ℃。

1.3.3 数据处理

使用风味分析仪配套的分析软件VOCal用于分析谱图和数据的定性定量，应用软件内置的美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）数据库和IMS数据库可对物质进行定性分析。运用Reporter插件直接对比样品之间的谱图差异（二维俯视图、三维谱图和差异谱图）。使用Gallery Plot插件进行指纹图谱对比。应用Dynamic PCA插件，制作动态主成分分析和相似度分析图。

2 结果与分析

2.1 不同年份黄酒挥发性风味物质GC-IMS图谱分析

不同年份黄酒样品挥发性风味物质的气相色谱-离子迁移谱见图1。横坐标1.0处红色竖线为反应离子峰（reactive ion peak，RIP），RIP峰两侧的每一个点代表一种挥发性有机物。颜色代表物质的浓度，白色表示浓度较低，红色表示浓度较高，颜色越深表示浓度越大。由图1可知，黄酒样品中挥发性有机物成分在2 500 s完成GC分离，在2 ms内完成IMS分离。大部分化合物能够在前1 000 s内出峰并有较好分离度。6个不同贮藏年份黄酒样品检测到的挥发性有机物种类大致相同，但各物质在含量上有所区别，随贮藏年份的延长而含量增高的挥发性成分可能对黄酒的风味具有重要贡献，可作为提升黄酒品质的参考依据。

图1 不同年份黄酒样品挥发性风味物质的气相色谱-离子迁移谱图Fig.1 Gas chromatography-ion migration chromatography of volatile flavor substances in Huangjiu samples with different years

2.2 不同年份黄酒的挥发性风味物质分析

通过GC-IMS检测出的挥发性风味物质检测结果见表1。由表1可知，6个不同贮藏年份黄酒样中共检出63种挥发性成分，其中，醇类11种，酯类27种，酮类8种，醛类6种以及其他类11种。酒样A08、A10、A12、A14、A18、A19的挥发性风味物质分别检出62种、61种、63种、62种、59种，其中，共有成分58种。6个样品的黄酒挥发性风味物质的总含量基本上随着年份的增长而逐渐减少，其挥发性风味物质总含量分别为955.42 μg/L、758.62 μg/L、593.8 μg/L、581.08 μg/L、528.89 μg/L、536.66 μg/L，其中，6个样品中检出挥发性风味物质为醇类、酯类、醛酮类物质等。这与王琳[15]通过顶空固相微萃取和气质联用法检测古南丰三年陈、五年陈、六年陈、八年陈和十年陈的年份黄酒中挥发性风味物质总量整体呈下降趋势的结果相符。

表1 不同年份黄酒中鉴定出的挥发性风味物质Table 1 Volatile flavor substances identified in different years of Huangjiu samples

酯类化合物是黄酒中最重要的风味化合物之一，酯类化合物在很大程度上可以决定黄酒所需的花香味、果香味等，酯类物质的不断积累也是黄酒越陈越香一个原因[16]。酯类化合物的含量随年份的增加而呈上升趋势。样品A08、A10、A12、A14、A18、A19的酯类物质中分别检测出24种、27种、27种、25种、27种、27种，其总酯含量分别为55.64 μg/L、62.13 μg/L、71.02 μg/L、76.61 μg/L、76.79 μg/L、92.56 μg/L。共有成分23种，分别为乙酸烯丙酯、醋酸冰片酯、乙酸丁酯、丙酸丁酯、2-甲基丁酸乙酯、二甲基戊酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、3-甲基戊酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、甲酸乙酯、己酸乙酯、异丁酸乙酯、乳酸乙酯、丙酸乙酯、甲酸香叶酯、己基丁酸酯、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、甲酸异丁酯、丁酸异丙酯、2-糠酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯、3-甲基丁酸甲酯。根据相关研究可知，乙酯类化合物的数量及其含量则在酯类化合物中占有绝对性的优势[9]。在本研究中，乙酸乙酯和乳酸乙酯同样在酯类中占比较大，黄酒样品A08、A10、A12、A14、A18、A19中乙酸乙酯和乳酸乙酯的质量浓度范围分别为12.47～23.16μg/L和11.65～30.21μg/L。乳酸乙酯具有水果香、奶油味[17]，而乙酸乙酯呈香蕉味、草莓味[18]，二者是对黄酒香气影响较大的物质。彭金龙等[19]添加不同糖化剂酿造黄酒，并对3种不同糖化剂所酿造的黄酒的部分挥发性风味物质进行检测，结果表明，乳酸乙酯与乙酸乙酯同样在酯类化合物中占比较大。

黄酒挥发性风味物质含量中占比最大的物质为醇类化合物，醇类化合物可由糖代谢、氨基酸脱氢脱羧作用产生，是陈化的酯类化合物的前体物质[20]。本研究中，6个黄酒样品的醇类物质中共检出11种，其总醇含量分别为867.21 μg/L、667.87 μg/L、494.43 μg/L、478.35 μg/L、424.51 μg/L、414.19 μg/L，醇类化合物含量随着贮藏时间的增长呈现下降趋势。江伟等[21]采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用法检测了不同酒龄的黄酒中34种风味物质，结果表明，在陈酿期间醇类化合物呈下降趋势，这与本研究结果相同。

醛酮类化合物同样是黄酒中重要挥发性物质之一，样品A08、A10、A12、A14、A18、A19的醛酮类物质中分别检测出13种、13种、14种、14种、13种、13种，共有物质13种。其中总酮含量分别为3.45μg/L、2.44μg/L、2.28μg/L、2.13μg/L、2.03 μg/L、1.64 μg/L，整体呈下降趋势；同样，总醛含量分别为16.24 μg/L、13.44 μg/L、11.29 μg/L、10.47 μg/L、9.01 μg/L、8.27 μg/L，有明显的下降趋势。醛酮类化合物通常具有特殊的香气，与酸类化合物对总体香气起到协调、融合的作用[22]，如糠醛呈焦糖香、苦杏仁香，这可使得黄酒具备与其他酒类极其容易区分的特征[23]。

本研究中所检出的酸类、蒎烯、醛类均有明显变化趋势，各有其独特的呈香特点，对黄酒风味物质的形成具有不容忽视的作用。由结果可知，醇类与酯类是黄酒中的主要挥发性风味物质，葛东颖等[24]采用电子鼻和气相色谱-质谱联用技术对不同原料酿造黄酒的风味品质进行比较研究发现，醇类和酯类物质为黄酒中最为重要的挥发性化合物，YE Y T等[25]采用气相色谱-嗅觉法（gas chromatography-olfactometry，GC-O）和气味活性值（odour active value，OAV）结合多变量数据分析，评价了15个不同发酵阶段制备的黄酒样品，证实醇类和酯类物质是黄酒中主要的挥发性风味物质。

2.3 不同年份黄酒GC-IMS指纹图谱分析

为了进一步比较不同年份黄酒样品中挥发性风味成分之间的差异，通过GC-IMS自带的Gallery Plot软件绘制指纹图谱，不同年份黄酒样品中挥发性风味物质指纹图谱见图2。图中每一横行表示一个样本的图谱，每个样本进行3次重复，右侧为样本名称，每一纵列表示为一种挥发性成分，下侧为挥发性成分的名称，其中点越红表示化合物的相对含量越高[21]。由图2可知，2-甲基1-丙醇、丁醇、乙醇、甲醇等醇类物质和丁酸乙酯、己基丁酸酯、十六烷内酯等酯类物质随黄酒年份增加逐渐增多。醋酸冰片酯、甲酸乙酯、2-乙酰基吡嗪、环己酮、乙醛等物质在酒样A08中的含量略高于其余几个年份黄酒，为其特征成分。乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸异丁酯、3-甲基丁酸甲酯、4-甲基戊酮、乙酸、己醛、四氢呋喃等物质在酒样A10中的含量较高，为其特征成分。酒样A12中特征成分比较多，3-甲基丁酸甲酯、3-甲基戊酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸异丙酯、2-糠酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯、乙酸烯丙酯、反式-2-戊烯醇、2-甲基丙烷、正丁醛、庚醛、二丁酮、4-甲基-3-戊烯-2-酮、1,4-二恶烷、丙醇等物质在酒样A12中含量较高。丙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯、二甲基戊酸乙酯、己酸乙酯、异丁酸乙酯、戊酸乙酯、γ-萜品烯、2-戊酮等物质在酒样A14中含量较高，为其特征成分。2-甲基丁醇在酒样A18中含量较高，为其特征成分。巴豆酸乙酯、乙酸丁酯、2-辛酮、3-（甲基异丙醇）-1-丙醇、辛醛等物质在酒样A19中含量较高，为其特征成分。结果表明，指纹图谱可根据以上特征成分判断不同年份黄酒样品中挥发性风味物质组成的主要差异。

图2 不同年份黄酒样品中挥发性风味物质气相色谱-离子迁移谱指纹图谱Fig.2 GC-IMS fingerprint map of flavor substances in different years of Huangjiu samples

2.4 不同年份黄酒挥发性风味物质主成分分析结果

主成分分析是识别算法中最基本的多元统计方法，同时能够利用降维的思想，将多指标转变为少数综合指标[22]。本研究以63种挥发性风味物质的峰强度作为分析对象，对不同年份黄酒进行主成分分析，结果见图3。由图3可知，主成分1与主成分2的累计方差贡献率为69%，表明该数据可以很好地反映样品的整体信息。其中，不同年份黄酒样品平行样间紧密聚集，表示样品间重复性较高，6个样本之间则有一定距离，样品A18和A19之间距离较近，具有一定相似性；样品A08和A10之间距离较近，同样具有一定相似性；其余样品距离较远，表明随着年份的增加样品挥发性物质发生了很大变化。结果表明，陈酿时间对酒体香气的影响显著，陈酿时间间隔越久，酒体香气变化越明显。说明PCA具有较好的分类效果，能直观的鉴别不同年份黄酒间的差异。

图3 不同年份黄酒样本的主成分分析结果Fig.3 Principal component analysis results of different years of Huangjiu samples

2.5 聚类分析结果

样本间欧氏距离对应于最邻近分析图，样品间差距越大，欧氏距离数值越大[23]。以63种挥发性风味物质峰强度作为分析对象进行最邻近分析，结果见图4。图中样品之间的距离最近，说明两者的相似度最高；反之距离较远，酒体风格则迥然不同。

图4 不同年份黄酒样品聚类分析结果Fig.4 Cluster analysis results of different years of Huangjiu samples

由图4可知，样品A08与A10最相近，与样品A19差异最大；而样品A12与样品A18和A19差异最大；样品A14与两个样品A18和A19更相似，与样品A12差异最大；两个样品A18和A19彼此之间比较相近，均与样品A12差异最大。结果表明，陈酿时间较长的黄酒可明显区别于陈酿时间较短的黄酒，说明在陈酿过程中，酒体会发生明显的变化，这一结论与主成分分析结果一致。

3 结论

本研究利用GC-IMS探究6个不同年份黄酒中挥发性风味物质的组成和变化规律，共检出63种挥发性风味物质，包括醇类11种，酯类27种，酮类8种，醛类6种以及其他类11种。GC-IMS结果表明，不同年份黄酒痕量组分和整体风味轮廓具有差异，其中，酒样A08特征成分为甲酸乙酯、己基丁酸酯、丁酸乙酯等，酒样A10特征成分为乙酸乙酯、乳酸乙酯等，酒样A12特征成分为3-甲基丁酸甲酯、3-甲基戊酸乙酯、丙酸乙酯等，酒样A14特征成分丙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯等，酒样A18特征成分为2-甲基丁醇，酒样A19特征成分为巴豆酸乙酯、乙酸丁酯等。主成分分析和聚类分析结果表明，酒样A18和A19之间具有相似性，酒样A08和A10之间具有相似性，而其余酒样均不具有相似性，表明在陈酿过程中，酒体会发生明显的变化。由于对酯类和醇类物质探测的高灵敏度等优势，GC-IMS可作为一种快速鉴定年份黄酒的检测手段，本研究结果可为黄酒的年份鉴别和质量控制提供经验借鉴和应用思路。