蓝莓酵素复合菌种发酵工艺优化及品质分析

杨彬彦，党 娅，3*，黎坤怡

（1.陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000；2.陕西省果业管理局秦巴山区蓝莓研究所，陕西 汉中 723000；3.陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723000）

蓝莓是抗氧化性最高的水果之一，富含活性酶和各种酚类物质，包括花色苷、黄酮醇和原花青素[1]。然而，由于蓝莓容易受到机械损伤、微生物腐烂和水分流失的影响，因此极易变质，导致保质期短[2]。为了解决这些问题，将蓝莓鲜果进行益生菌发酵用于生产蓝莓酵素，可提高食品保质期、营养及感官品质，并去除食品基质中的不良化合物[3]。

随着人们养生意识的增强，酵素因其较高的营养价值和保健功能逐渐出现在大众的视野中[4]。酵素是指以动物、植物、菌类等为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品[5]。蓝莓浆果经过微生物发酵不仅可以提高蓝莓浆果的利用率，还能提高原料营养多样性和生物活性[6-7]。而益生菌发酵菌种对蓝莓酵素的品质和口感密切相关。益生菌的定义为“当摄入足够量时，为宿主提供健康益处的活的微生物”[8]。基于乳酸菌的发酵有助于提高食物的营养价值和消化率，控制潜在感染，还与功能性生物活性物质有关[9]。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是最常用于发酵植物性食品的菌种[10]。干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）可以产生各种活性酶，将原料基质转化为功能性成分[11]。酵母菌能够促进乳酸菌等有益菌群繁殖，抑制病原微生物生长，提高食物消化率及增强人体免疫力[12]。利用益生菌在水果基质中发酵比乳制品更复杂，并且生长受其他微生物和发酵条件的影响，例如pH、温度、时间等[13-14]。目前，已有关于发酵菌种制备蓝莓酵素的研究报道[15-16]。LI S J等[17]从水果中筛选出植物乳杆菌和发酵乳杆菌，发现其在蓝莓汁中具有良好的发酵能力，活菌数超过10.0 lg CFU/mL，同时提高了酚类含量和抗氧化能力。白琳等[18]利用植物乳杆菌、乳酸片球菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌发酵蓝莓果汁，均匀设计确定其最佳接种体积比例分别为22.45%、42.86%、14.29%、16.33%、4.10%，响应面优化最佳发酵工艺为发酵时间36 h，发酵温度37 ℃，初始接种量5.5×106CFU/mL，初始总可溶性固形物（total soluble solid，TSS）含量为11°Bx，发酵后蓝莓酵素的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力达87.45 U/g。李虹甫等[19]选择植物乳杆菌J26对蓝莓果汁在发酵温度37 ℃、发酵时间24 h、发酵剂接种量3%的条件下进行发酵，活菌数可达1×109CFU/mL。然而，我国的蓝莓酵素还处于初步阶段，其生产研究和产业化都不完善[20-23]。此外，发酵工艺还存在原料利用率低；发酵参数变化复杂、难以控制且发酵周期较长；营养成分损失大、成本高、品质低、效率差等问题。

本研究以蓝莓为主要原料，以酵母菌、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）为发酵菌种制备蓝莓酵素，以SOD酶活性为考察指标，首先通过均匀设计试验确定复合菌种的最佳体积接种比例；其次通过单因素试验，考察发酵时间、发酵温度、初始总可溶性固形物含量及料液比对超氧化物歧化酶（SOD）活力的影响；最后通过响应面试验获得最佳发酵工艺条件。以期生产具有高抗氧化能力的新型发酵非乳制饮料，为生产品质优良、营养丰富的蓝莓酵素提供理论依据和技术支持，提高蓝莓的利用率和附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜蓝莓：产自陕西汉中；葡萄酒果酒专用酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：西安沣东新城永胜食品厂；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）21809、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）6104：中国工业微生物菌种保藏管理中心；果胶酶（30 000 U/g）、纤维素酶（100 000 U/g）、半纤维素酶（50 000 U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；MRS肉汤培养基：北京奥博星生物技术有限公司；总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；冰乙酸（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；氯化钠（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

T6紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；DSX-18L高压蒸汽灭菌锅：上海博讯医疗生物仪器有限公司；TDZ4A-WS台式低速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：上海浦东物理光学仪器厂；NR-EW63WXA-H冰箱：中国海尔公司；CP114电子天平：奥豪斯仪器（常州）有限公司；PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器有限公司；JYL-C50T打浆机：九阳股份有限公司；DH3600BⅡ电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器公司；SW-CJ-2FD洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；手持式折光仪：艾普计量仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蓝莓酵素加工工艺流程及操作要点

蓝莓预处理→清洗、打浆→酶解→调整糖度→灭菌→接种→发酵→静置→过滤→蓝莓酵素成品

操作要点：

酵母菌活化：将葡萄酒果酒专用酵母用10倍蒸馏水搅拌均匀至溶解，放置在30～35 ℃恒温水浴锅中活化30 min，当出现大量泡沫即表明活化完毕，取出备用。植物乳杆菌（干酪乳杆菌）活化：将斜面保藏的植物乳杆菌（干酪乳杆菌）在MRS肉汤培养基中活化，两次继代培养后，36 ℃条件下静置培养48 h，备用。

将冷冻的蓝莓（-20 ℃）在4 ℃解冻后清洗晾干，用榨汁机破碎得到蓝莓果浆，在55 ℃条件下加入0.8%的果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶（2∶1∶1）酶解3 h[18]。酶解结束后向蓝莓果浆中加入一定量的白砂糖，调整初始TSS含量为12°Bx。采用巴氏杀菌法杀菌（85 ℃、15 min）。将活化完成的酵母菌、植物乳杆菌及干酪乳杆菌接种发酵（采用血球计数板在显微镜下计数保证菌种的活菌数达到109CFU/mL，体积比为0.1%、2%、0.47%），在31 ℃发酵40 h，4 ℃条件下静置2 h、使用纱布对其过滤，获得蓝莓酵素成品。

1.3.2 复合菌种接种量优化均匀设计试验

根据成福等[24-25]的方法进行3因素8水平的试验设计。均匀设计试验中，以SOD酶活性、pH值为响应值，以3种复合菌种（酵母菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌）的接种体积比例为影响因素。在温度为31 ℃，初始TSS含量为12 °Bx，料液比为1∶5的条件下发酵40 h，均匀设计试验因素与水平见表1。

表1 复合菌种接种量优化均匀设计试验因素及水平Table 1 Factors and levels of uniform design tests for inoculum optimization of mixed strains

1.3.3 发酵条件优化单因素试验

固定各菌种初始接种量为109CFU/mL，参考上述工艺固定其他指标，考察发酵时间（32 h、36 h、40 h、44 h、48 h）、发酵温度（28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃）、料液比（1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8（g∶mL））、初始TSS含量（9°Bx、10°Bx、11°Bx、12°Bx、13°Bx）4个因素对SOD酶活力的影响。

1.3.4 发酵条件优化响应面试验

在单因素试验结果的基础上，以SOD酶活（Y）为响应值，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，选择发酵时间（A）、发酵温度（B）、初始TSS含量（C）、料液比（D）4个因素为自变量，采用4因素3水平的响应面试验，优化蓝莓酵素发酵的最佳工艺条件。发酵条件优化响应面试验因素与水平见表2。

表2 发酵条件优化响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization

1.3.5 分析检测

pH值的测定：采用pH计；SOD酶活力的测定：采用SOD酶试剂盒；总可溶性固形物含量的测定：采用折光计法；乳酸菌活菌数的测定：参照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》。总花色苷含量的测定：采用pH示差法[26]。酒精度的测定：参照GB 5009.225—2023《酒中乙醇浓度的测定》；总酚含量的测定：采用福林酚法[27]。

1.3.6 数据处理

试验均重复3次，结果以“平均值±标准差”表示，采用SPSS 24.0软件进行统计分析和处理，Origin 2021进行绘图，Design-Expert 13.0进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 复合菌种接种量优化均匀设计试验结果与分析

均匀设计试验优化复合菌种接种量的结果与分析见表3。

表3 复合菌种接种量优化均匀设计试验结果与分析Table 3 Results and analysis of uniform design tests for inoculum optimization of mixed strains

由表3可知，在8组试验中，各组试验的pH值差异不明显，SOD酶活显示出较大不同。故以SOD酶活（Y）为响应值，运用SPSS 24.0软件建立二次多项式回归方程如下：

Y=18.756-32.227X2+561.391X3-8.976X1X2+4.393X22-587.476X3X2

对回归方程进行方差分析，决定系数R2=0.96，调整决定系数R2adj=0.92，F值为11.77，P值为0.01＜0.1，达到极显著水平，证明该回归方程可以较准确地预测最佳接种量。运用Excel 2016预测蓝莓酵素的最佳接种量分别为酵母菌0.1%、植物乳杆菌2%、干酪乳杆菌0.47%，在此条件下，SOD酶活达105 U/mL。根据预测出的最佳条件进行3次平行验证试验，得出蓝莓酵素的SOD酶活为101 U/mL。

2.2 发酵条件优化单因素试验结果

发酵温度、发酵时间、初始可溶性固形物和料液比对蓝莓酵素SOD酶活力的影响见图1。

图1 发酵时间（A）、发酵温度（B）、初始总可溶性固形物含量（C）和料液比（D）对蓝莓酵素SOD酶活的影响Fig.1 Effects of fermentation time (A), temperature (B), initial total soluble solid content (C), and solid and liquid ratio (D) on SOD activity of blueberry Jiaosu

由图1A可知，随着发酵时间在32～40 h范围内延长，SOD酶活逐渐增加；发酵时间为40h时，SOD酶活达到最大，为102 U/mL；发酵时间＞40 h，SOD酶活力降低。因此，确定最佳发酵时间为40 h。由图1B可知，随着发酵温度在28～31 ℃的升高，SOD酶活逐渐增加；发酵温度为31 ℃时，SOD酶活达最高值，为92 U/mL；当发酵温度高于31 ℃时，SOD酶活力逐步下降。因此，确定最佳发酵温度为31℃。由图1C可知，随着初始TSS含量的升高，SOD酶活力逐渐增加；当初始TSS含量为12°Bx时，SOD酶活力达最大值，为105 U/mL；当初始TSS含量＞12°Bx时，SOD酶活力逐渐下降。因此，确定最佳初始TSS含量为12°Bx。由图1D可知，当料液比为1∶4、1∶5（g∶mL）时，SOD酶活力逐渐增加；当料液比为1∶5（g∶mL）时，SOD酶活达最高值，为102 U/mL；当料液比为1∶5、1∶6、1∶7、1∶8（g∶mL）时，SOD酶活逐渐下降。因此，确定最佳料液比为1∶5（g∶mL）。

2.3 发酵条件优化响应面试验结果与分析

在单因素试验结果的基础上，以SOD酶活（Y）为响应值，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，选择发酵时间（A）、发酵温度（B）、初始TSS含量（C）、料液比（D）4个因素为自变量进行4因素3水平的响应面试验，优化蓝莓酵素发酵的最佳工艺条件。发酵条件优化响应面试验设计及结果见表4，方差分析见表5。

表4 发酵条件优化响应面试验设计与结果Table 4 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization

表5 回归模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

通过Design-Expert 13.0软件对表4结果进行方差分析和二元多次回归拟合，获得SOD酶活与发酵时间、发酵温度、初始TSS含量、料液比的二次多项式回归方程如下：

Y=105.52-1.89A+1.29B+0.78C+0.39D-3.48AB+1.88AC+0.4AD-

1.93BC+0.14BD-1.91CD-12.13A2-8.93B2-11.08C2-6.33D2

由表5可知，该模型极显著（P＜0.000 1），失拟项P值为0.472 7＞0.05，即失拟项不显著，决定系数R2=0.991，调整决定系数R2Adj=0.983，说明此模型拟合效果良好，能够分析预测蓝莓酵素的发酵工艺参数。由P值可知，一次项A、B，交互项AB、AC、BC、CD，二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01）；一次项C对结果影响显著（P＜0.05）；其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，各因素对SOD酶活影响大小顺序为A＞B＞C＞D。

响应面的等高线形状及响应面坡度可以反映自变量之间的交互影响，响应面坡面越陡，表明因素之间的相互作用越显著。由图2可知，发酵时间（A）与发酵温度（B）、发酵时间（A）与初始TSS值（C）、发酵温度（B）与初始TSS（C）、初始TSS含量（C）与料液比（D）之间存在交互作用，且这些因素的相互作用对SOD酶活力影响极显著（P＜0.01）。

图2 各因素间交互作用对蓝莓酵素SOD酶活影响的响应曲面及等高线Fig.2 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on SOD activity of blueberry Jiaosu

根据响应面试验结果得到蓝莓酵素的最佳发酵工艺条件为发酵时间41.43 h，发酵温度31.09 ℃，初始TSS含量12.04 °Bx，料液比1∶4.99（g∶mL）。在此优化条件下，蓝莓酵素的SOD酶活力预测值可达103.29 U/mL。为方便实际操作，将最佳发酵工艺条件修正为发酵时间41.5 h，发酵温度31 ℃，初始TSS含量12°Bx，料液比1∶5（g∶mL），在此条件下进行3次平行验证试验，得到SOD酶活实际值为103.01 U/mL，与预测值相差不大。

2.4 蓝莓酵素的品质评价

蓝莓酵素成品呈深紫红色，色泽均匀，果香浓郁，口感酸甜适宜，无外来杂质。制备的蓝莓酵素pH值为3.14，酒精度为0.2%vol，总酚含量为3.14 mg/mL，花色苷含量为26.06 mg/mL，乳酸菌活菌数为1.01×107CFU/mL，SOD酶活性为103.01 U/mL，符合行业标准QB/T 5323—2018《植物酵素》要求。

3 结论

该研究以蓝莓为主要原料，以酵母菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌为发酵菌种制备蓝莓酵素，确定酵母菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌三种菌株的最佳接种体积比分别为0.1%、2%、0.47%，蓝莓酵素的最佳发酵工艺条件为发酵时间41.5 h，发酵温度31 ℃，初始总可溶性固形物含量12°Bx，料液比1∶5（g∶mL）。在此优化条件下，蓝莓酵素的SOD酶活力可达103.01 U/mL，pH值为3.14，酒精度为0.2%vol，总酚含量为3.14 mg/mL，花色苷含量为26.06 mg/mL，乳酸菌活菌数为1.01×107CFU/mL。本研究开发出一款具有高SOD酶活力的蓝莓酵素产品，今后可进一步研究酵素制品对人类健康的益处。