具有生物活性的丝蛋白骨材料研究进展

史红叶 丁召召 肖丽媖 吕强

一、骨修复材料的基本类型和发展

由各种原因导致的骨缺损是临床患病率最高的疾病之一，可极大影响人们的生活质量。尽管自体和异体骨移植能够有效修复部分骨缺损，由于供体来源的极度缺乏，开发能够有效填充骨缺损部分，并能替代骨的生理功能或促进骨再生的骨修复材料一直是再生医学的研究热点［1］。骨修复材料及其相关器械也是发展历史最为悠久、品种最为丰富、临床用量最大的医疗器械品类。根据临床的具体需求，研究更好促进骨修复和功能替代的材料及器械具有巨大的科学价值和应用价值［2］。

目前，根据使用材料的不同，骨修复材料包括无机陶瓷、脱细胞基质、金属骨替代材料、合成高分子骨材料、天然高分子骨材料以及不同复合材料等［3-8］；根据用途不同，可制备成骨粉、多孔海绵、凝胶、板材、可注射骨水泥等不同形态［9-14］。随着对骨再生修复理解的不断深入，骨修复材料的开发理念逐渐改变，具有生物活性的骨修复材料成为重要发展方向［15-17］。如何有效调控细胞和组织行为，主动加快骨再生速率，提升再生骨修复质量，真正实现不同类型骨缺损患者的组织功能恢复是生物材料专家和临床医生的共同追求。

二、骨修复材料的生物活性设计

针对不同类型骨缺损的特定环境，结合对骨再生过程的理解，通过不同的调控信号的仿生设计和模拟，构筑能主动诱导细胞和组织行为的微环境是优化骨修复材料生物活性设计的主要策略［18］。临床医学、生物学和材料学不同学科的融合发展可进一步强化对骨再生和修复机制的认知，不断丰富骨修复材料生物活性设计的方法和调控体系，形成不同类型的生物活性骨材料。

1. 物理信号仿生骨材料：骨组织细胞外基质的各种物理信号是调控细胞行为和组织再生的有效靶点。材料的物理组成、力学性能、微纳结构、取向形态、电信号、磁信号等均可以诱导细胞的增殖与分化，改善骨缺损修复的血管化能力和骨再生能力［19-24］。根据不同的物理信号，有机-无机矿化复合仿生骨材料、力学诱导骨分化的骨材料、具有仿生纳米纤维-微孔多级结构的海绵状骨材料、具有取向诱导结构的仿生骨材料，以及通过外源性调控电信号和磁信号均可主动诱导骨再生［25-30］，且通过物理信号的优化和调整，可有效改善再生骨组织的愈合速率和愈合质量，同时证明了物理信号主动调控骨再生的有效性。

2. 化学和生物信号仿生骨材料：骨再生是由细胞、组织以及细胞/组织所分泌活性成分协同介导的过程。基于对骨发育和骨再生过程的理解，可将小分子抑制剂、生物活性分子、生长因子、外泌体等引入骨修复材料，通过活性成分的可控释放或固定调控细胞和组织行为，实现化学和生物信号的作用。目前有多种有机无机载体已成功制备，并同骨修复材料相结合［31-37］。如何动态调控不同的化学和生物信号，使其同骨再生过程匹配是提高骨修复性能的关键。

3. 针对不同骨缺损环境的骨修复材料：不同部位、不同类型的骨缺损对再生微环境具有不同的要求。例如，感染性骨缺损不仅需要材料具有骨诱导性，同时需要材料能够抗菌，在抑制感染的同时，促进骨组织再生［38-39］。骨软骨界面则需要根据骨和软骨对材料结构和性能的不同要求，制备具有各向异性分层结构的生物活性骨材料，实现骨和软骨组织的分别调控［40-42］。而针对骨质疏松导致的骨折和骨缺损，骨修复材料在有效促进骨组织再生的同时，需要能够抑制破骨细胞生成，以提升骨修复质量［43-44］。针对特定部位和特定类型骨缺损进行材料的个性化设计，构筑适宜微环境，已经成为具有生物活性的骨材料研究的热点方向。

4. 结合干细胞的骨修复材料：干细胞技术和组织工程的发展为生物活性骨材料的设计提供新的思路。不同类型的干细胞被成功融入骨材料，并通过材料理化性能的调控来诱导干细胞行为，加快骨缺损的愈合速率，实现骨组织的功能恢复［45-48］。不同干细胞的固定、活性保持以及行为调控是影响含干细胞骨材料修复性能的关键。

5. 多因素复杂微环境主动调控的骨修复材料：随着生物活性骨材料研究的不断深入，不同类型调控信号的协同作用对骨再生的影响逐渐被熟知。结合不同生物材料和不同制备方法，将多种物理、化学和生物信号融合到同一骨修复材料，并通过材料的智能化设计，优化不同信号的功能，可实现骨再生能力的持续改善［49-54］。结合对骨再生不同阶段的不同细胞其作用动态变化的理解，开发制备多种调控信号可时空设计的生物活性骨材料，更好诱导骨修复进程，有望突破自体骨修复的性能局限。

三、丝蛋白作为骨修复材料的特点和优势

1. 生物相容性：优异的生物相容性是组织修复材料的基本要求。同其他天然生物材料如胶原、透明质酸等相似，丝蛋白具有比合成生物材料更好的生物相容性。干细胞、成骨细胞、巨噬细胞等均能够在丝蛋白材料上粘附和生长，完全满足骨再生对材料生物相容性的要求［55-59］。丝蛋白免疫原性低，具备天然的抗炎性，适用于多种组织的再生修复，对疤痕组织的形成有抑制作用［60-61］。考虑到类蚕丝蛋白是调控生物矿化的关键蛋白，特定结构丝蛋白还能够诱导骨组织关键成分羟基磷灰石的形成，赋予丝蛋白一定的骨诱导性［62-64］。

2. 优异的力学性能：合适的力学性能是决定骨诱导性和骨替代性能的关键因素。同其他天然高分子相比，蚕丝力学性能更为优异，适用于骨缺损修复。然而，经溶解再生的丝蛋白海绵力学性能较弱，难以在骨缺损部分提供有效的力学支撑。以高浓度的丝蛋白溶液为基质，通过热压、冻干、交联等方式已成功制备高强度丝蛋白骨材料，并开发出丝蛋白骨钉骨板等产品，在动物实验中已取得良好效果［65-68］。与此同时，将物理交联和化学交联相结合，可提高丝蛋白分子的相互作用，改善丝蛋白聚集态结构，制备出具有力学骨诱导性的丝蛋白凝胶及多孔冷冻凝胶，实现对不同部位骨缺损的成功修复［69-71］。

3. 良好的活性成分载体：具有生物活性的骨材料通常需要引入各种活性成分以主动诱导细胞行为和组织再生，加载不同活性成分的载体体系是生物体活性骨材料的重要组成部分。除了作为骨修复的基质材料，丝蛋白可制备成凝胶、微球、纳米颗粒、微胶囊等不同载体，通过主动调节丝蛋白的构象组成和聚集态结构，以满足不同亲疏水活性成分加载和可控释放的要求［72-75］。目前，以丝蛋白为载体实现了水溶性、脂溶性大分子或小分子药物、不同类型生长因子等的高效加载和控释［76-80］，旨在为不同组织的再生提供多种动态变化的化学和生物信号，有效提升不同组织的修复质量。

4. 可控的可降解性：同其它组织相比，骨组织修复需要更长时间，同骨再生相匹配的降解性能可提高组织修复质量。以胶原或透明质酸为基质的组织修复材料降解速率较快，更适用于软组织的修复。天然蚕丝在体内缓慢吸收，降解时间一般在半年以上，降解性同骨组织具有较好匹配性［81］。再生丝蛋白制备的海绵、凝胶、膜等，其降解行为受构象组成、聚集态结构影响，表现出良好的可调控性［82-85］。体内和体外研究结果表明，不同丝蛋白基骨材料均可在骨组织再生过程中保持结构和形态，为骨修复提供有效的支撑和引导［86-89］。

5. 结构和性能可设计性：多因素仿生微环境的构建是提高骨修复材料生物活性的有效策略，也对生物材料的可设计性提出更高要求。同其它材料相比，丝蛋白具有优异的结构和性能可设计性，不仅可根据不同应用需求，制备成海绵、粉末、凝胶、薄膜等不同形态，也可采用不同制备方法，实现对多种物理信号的可控模拟［90］。蚕丝蛋白可自组装形成仿细胞外基质纳米纤维。在此基础上，利用冻干、电场诱导、交联等多种方法，对骨组织细胞外基质的纳米纤维-微孔多级结构、取向形态、力学性能等进行仿生构建［91-95］。丝蛋白能够制备成不同载体，同丝蛋白骨材料基质融合，丰富物理、化学、生物诱导信号的主动设计。静电纺丝、3D 打印等不同复杂结构制备技术均可应用于丝蛋白材料的制备，进一步提升材料结构和性能的可设计性。

四、生物活性丝蛋白骨材料研究进展

根据生物活性材料的功能目标设计的差异，具有生物活性丝蛋白骨材料可分为骨修复性能优化的丝蛋白骨材料、针对特定骨组织缺损的丝蛋白骨材料以及多功能生物活性丝蛋白骨材料，证明生物活性丝蛋白骨材料在骨再生领域广阔的应用前景。

1. 骨修复性能优化的生物活性丝蛋白骨材料：考虑到天然蚕丝优异的力学性能，利用不同方式提高丝蛋白基骨材料的力学性能是改善骨诱导性，优化骨再生能力的有效手段。将硅纳米颗粒分散到丝蛋白纳米纤维中制备复合凝胶，在模拟天然骨组成和微结构的同时，显著提升了凝胶力学强度，获得优异的骨诱导性［96］。热压法是David Kaplan 开发的制备高强度丝蛋白材料的有效方法，在热压基础上，将羟基磷灰石同丝蛋白结合制备热压材料，力学信号和羟基磷灰石的骨诱导性协同作用，实现骨诱导性的进一步提升［97］。精细化调控有机-无机复合材料的组成同样可改善材料的力学性能。另外将更易于吸收的磷酸八钙加入丝蛋白海藻酸复合支架，制备力学性能更为优异的复合骨材料，其诱导干细胞分化成骨细胞的能力明显改善［98］。随后，受蚕丝吐丝的启发，有人开发新的3D打印技术，成功制备高强度丝蛋白羟基磷灰石复合材料，实现了对大鼠腿骨缺损的有效修复［99］。通过材料组成、制备方法的改进和融合不断提升材料的力学性能，丝蛋白生物活性骨材料研究得到了持续关注。血管化是加快骨愈合速率，提高骨愈合质量的关键步骤。在骨诱导性的基础上，赋予材料血管化能力可进一步提高材料促骨再生性能。通过固定和缓释不同活性成分成功开发多种促血管化的丝蛋白骨材料。利用丝蛋白和其它载体加载和控释去铁胺、丹参酸等活性成分，制备兼具血管化和骨诱导性的丝蛋白基骨材料，在动物骨缺损修复中取得了良好的治疗效果［100-101］。具有生物活性的生物玻璃、多肽等同样可促进再生组织快速血管化［102］。将丝蛋白同含铜离子的生物玻璃、特定多肽复合制备骨材料，结合3D 打印技术设计合适的多孔结构，再生骨组织的血管化水平和骨愈合质量均明显提高［102-103］。血管化和骨诱导性的动态变化能够进一步影响骨再生性能。在血管化和骨诱导性基础上，利用合适的载体组合和成分设计，开发出可序贯释放不同离子和因子的丝蛋白基骨材料，并获得理想的治疗效果［104-105］。除了信号的动态变化，微环境的精细化模拟同样是持续改善生物活性的可行方法。考虑到骨缺损部位特殊的微环境，将单宁酸同丝蛋白结合制备水凝胶，进而联合多肽E7 的控释在降低骨缺损部分活性氧的同时，促进干细胞的增殖以及骨-软骨缺损的再生［106］。除了骨诱导性和血管化的调控和优化，不同信号通路调控细胞行为为调控骨组织的修复提供了更多思路。例如，将磁性离子同丝蛋白复合，利用外源性磁场调控磁性粒子进而影响细胞行为，可在显著减少活性氧对细胞损伤的同时，提高干细胞向成骨细胞分化的能力［107］。与此类似，将二维MXene 材料同丝蛋白复合制备纳米凝胶，通过形成电场微环境，主动调控免疫微环境、血管再生及骨再生，实现骨缺损的快速修复［108］。制备方式和调控因素的不断丰富为具有生物活性丝蛋白骨材料的设计提供更多的可行策略。

2. 基于特定骨组织的生物活性丝蛋白骨材料设计：不同类型骨组织、不同部位骨组织的再生修复的微环境存在显著差异，根据特定骨的类型和部位对生物活性骨材料进行个性化设计是提高生物活性的关键。为更好改善丝蛋白骨材料在不同类型骨修复中的适应性，已开发出多种具有特定组成和仿生结构的骨材料，取得良好的修复效果。考虑到长骨等骨组织包括皮质骨、松质骨和骨髓等不同部分，将多个制备方法结合，仿生制备包括不同分区的仿生骨材料，并尝试进行了萎缩性骨不连的修复［109］。随后，针对软骨特殊的相对缺氧环境，将缺氧环境下干细胞外泌体同丝蛋白凝胶结合，进行软骨缺损修复，可取得更好的治疗效果［110］。软骨缺损修复不仅需要提高软骨细胞的增殖，同时要抑制细胞凋亡；将中药活性成分丹参酮加入丝蛋白支架，通过丹参酮的缓释刺激软骨细胞合成细胞外基质，再生软骨的细胞基质含量、力学性能均显著提高［111］。腔隙性骨修复需要骨材料具有可注射性并能有效填充不规则缺损部位，为实现腔隙性骨缺损的治疗，研究发现一种可注射自适应丝蛋白、生物玻璃、海藻酸盐复合凝胶，不仅解决可注射和有效填充的问题，同时具备促血管化能力和骨诱导性，在腔隙性骨缺损治疗中具有显著优势［112］。同正常患者相比，骨质疏松患者的骨缺损修复在提高骨诱导性的同时要抑制破骨细胞的作用。将锶离子和人参皂苷加入丝蛋白-明胶支架可改善骨质疏松患者的骨修复效果［113］。其中，锶离子可以在提高骨诱导性同时抑制巨噬细胞的破骨作用，而人参皂苷则带来血管化能力的提升，两者协同作用，成功促进骨质疏松患者骨缺损的快速修复。

骨缺损通常伴随其它相邻组织的损伤，不同组织再生需要各自适宜的微环境。为更好满足骨和相邻组织缺损同时修复的需求，利用多种方法制备具有分层或各向异性的丝蛋白骨材料，实现对多个组织的同时修复。骨-软骨损伤是临床发病率较高的典型多组织缺损病例，根据骨软骨结构的不同进行材料的分区设计是骨-软骨修复的常用策略。将3D打印和交联方法结合，制备力学性能不同的双层丝蛋白支架，分别诱导骨和软骨再生［114］。基于相似的策略，还设计制备出具有不同取向结构的多层丝蛋白基骨材料，模拟骨-软骨不同部位的微结构，改善组织的修复性能［115-116］。丝蛋白材料优异的可设计和同其它材料/成分的兼容性使其能够根据不同类型组织缺损的个性化需求进行主动调控，更好匹配不同组织的再生进程。

3. 多功能生物活性丝蛋白骨材料：骨作为人体的重要力学支撑组织，其缺损修复过程中需要考虑患者运动对修复性能的影响。尽管不同固定方式可以减轻运动对修复的副作用，通过材料的智能化设计来避免运动的负面影响有望带来更好的临床治疗效果。在丝蛋白-羟基磷灰石生物活性骨材料研究基础上，利用单宁酸对丝蛋白进行改性，制备了具有粘附性能的高强度丝蛋白凝胶［117］。上述凝胶可以将骨折部分在生理环境下牢固固定，同时主动诱导骨组织再生。随后，利用动态主客体相互作用，继续开发出具有自愈合性能的丝蛋白羟基磷灰石凝胶骨材料，实现股骨缺损的有效修复［118］。缺损组织的细菌感染是导致组织修复失败的重要因素。为进一步提升生物活性丝蛋白骨材料的临床治疗效果，将抗菌肽同具有仿生结构的高强度丝蛋白基骨材料结合，制备具有抗菌性的生物活性骨材料，在保持材料优异骨诱导性的同时，有效避免细菌感染，更好满足临床需求［119］。

骨肿瘤导致的骨缺损近年来发病率不断提升，其治疗需要兼顾肿瘤消除和骨组织再生两个方面。将生物相容性的聚多巴胺和丝蛋白进行组装，制备具有近红外光响应性的多功能生物活性支架，在促进骨再生的同时，可通过近红外光激发的光热效应对骨肿瘤进行治疗，结合光纤技术，具有一定的临床应用前景［120］。基于相似的制备策略，将二维Mxene 纳米片引入丝蛋白-纤维素复合支架，纳米片赋予支架近红外光激发的光热效应来实现骨肿瘤的消融，而高强度丝蛋白-纤维素支架能为骨缺损的再生提供合适的微环境［121］。骨肿瘤切除后的肿瘤转移经常导致治疗的失败。骨肿瘤切除后的骨缺损再生和肿瘤转移抑制是临床治疗需要同时关注的重点。另有研究将黑磷量子点同木纤维-丝蛋白仿生支架结合，在骨修复同时有效抑制肿瘤转移，具有潜在的临床应用价值［122］。以具有生物活性的丝蛋白骨材料为平台，融合各种肿瘤治疗方法，有望为骨肿瘤的治疗提供新的可行策略。

五、未来研究前景和挑战

1. 丝蛋白骨材料临床转化的挑战：同其它生物材料相比，丝蛋白在多种因素的引入和调控方面具有显著优势，可根据不同类型骨缺损的具体需求，实现材料的个性化设计，取得更好临床效果。结合其相对低廉的价格和来源丰富的特点，更有利于实现丝蛋白基医疗器械的转化，在基础研究和产品开发方面均具有极大潜力。然而，同基础研究不同，丝蛋白骨材料产品的临床转化面临多个现实瓶颈，为更好实现从实验室到临床产品的突破，需要结合具体临床和市场需求，解决如下关键问题：（1）丝蛋白医用原料的稳定规模化制备：丝蛋白复杂多变的结构为基于不同需求的个性化设计提供更好可能，但同时导致丝蛋白原料难以通过工艺调控实现稳定制备。稳态医用丝蛋白溶液或固体原料的制备成为制约材料从实验室转变成产品的技术瓶颈。利用对丝蛋白自组装规律理解，开发结构均一、可重复规模化制备的丝蛋白原料是实现骨材料产品开发突破的前提和基础。（2）医疗器械产品的注册审批：同胶原、透明质酸等已有多种相关医疗器械产品不同，蚕丝蛋白三类医疗器械目前国内仅有两个获得注册证，而蚕丝蛋白骨材料的产品未见产品通过注册审评。丝蛋白医疗器械相关标准的缺乏导致产品注册审评存在更多困难，需要从技术、安全性和有效性等多个方面同药监审评部门进行更为充分的沟通。（3）临床导向的产品开发设计：丝蛋白具有特殊的结构和性能，融合临床具体需求和材料特点，对产品进行针对性设计是临床应用突破的关键。然而，丝蛋白结构和性能的复杂性使得临床医生需要更多时间和精力对其进行了解，通过合适的机制优化丝蛋白材料开发者和临床医生的合作，真正构筑临床导向，医工融合的产品开发模式将成为决定丝蛋白骨材料临床成功转化的决定因素。

2. 丝蛋白骨材料的发展趋势：多因素复杂微环境的仿生设计需要解决多种因素引入所使用不同方法的兼容性问题。如何充分发挥丝蛋白可设计性和兼容性的优势，融合更多制备方法和改性手段，是持续开发多功能生物活性丝蛋白骨材料的必由之路。多种因素同样存在相互的影响，以多因素仿生的丝蛋白材料为平台，研究不同因素的相互影响和协同作用，结合细胞学/生物学的研究成果，有利于加深材料诱导骨再生机制的理解，同时为骨材料生物活性性能的优化提供指导和方法支持。多学科的融合和合作是决定丝蛋白骨材料未来发展的重要因素。根据丝蛋白材料的特点和临床需求，丝蛋白骨材料的研究将可能从如下两个方面获得系列突破。（1）时空信号调控的丝蛋白骨材料研究：骨组织不仅具有复杂的分区分级结构和组成，同时愈合过程中不同细胞、不同信号需要动态变化，以真正实现组织的功能修复。根据骨愈合的自然过程，实现多种物理、化学、生物信号的空间和动态仿生设计是主动调控细胞和组织行为，提升组织再生质量的核心策略。同其他材料相比，丝蛋白不仅具有结构和性能的可设计性，同时兼做不同活性成分或细胞的载体，是突破研究局限，实现多种信号时空调控的合适平台。具有时空调控性能的丝蛋白骨材料也是未来研究的重要方向。（2）具有诊疗功能的丝蛋白骨材料研究：随着多学科的融合发展，丝蛋白光电材料、信息、能源材料等逐渐成为新兴的研究方向，其兼具生物相容性和功能性，使其在生物医学领域独具优势。将丝蛋白光电、信息、能源材料同丝蛋白骨材料结合，开发具有实时监测、智能调控的诊疗一体化丝蛋白骨材料，可能成为多学科融合解决临床问题的典范，是丝蛋白骨材料逐渐兴起的新领域。