丝蛋白应用于骨软骨损伤修复的研究进展与展望

邵正中 舒雄 管娟

丝蛋白（silk fibroin，SF）是从动物丝中提取的天然蛋白质，主要包括蚕丝蛋白和蛛丝蛋白。SF 材料的体内生物相容性优于一般的合成生物高分子如聚酯［1-2］。同时，典型纯SF 材料如SF 水凝胶比其他天然蛋白质如胶原、明胶的力学性能更优、降解更慢［1-2］。因此，SF材料是组织工程与再生医学领域的研究热点之一。目前，蛛丝蛋白作为组织工程材料的研究相对较少，聚焦于桑蚕丝来源的SF 材料研究颇多。大量研究表明，通过化学和物理交联等方法可以在宽范围内调节SF生物材料的力学性能和生物学性能以适配不同的应用需求［3-4］。在软骨、骨修复领域，SF生物材料也体现出巨大的研究价值和应用前景［5-6］。

一、丝蛋白

目前，广泛采用从桑蚕丝中提取SF 的方法［7］。将脱胶蚕丝溶解于高浓度的溴化锂溶液中，经透析获得SF水溶液，进而制备出海绵、支架、薄膜、模塑体和水凝胶等形式丰富的SF基材。近年来，前沿的3D打印技术又实现了SF基材的复杂微结构和个性化定制［8］。桑蚕丝SF 包含轻链和重链两种分子，分子量分别为28 kD 和391 kD，轻链的序列结构缺少重复片段，以无规构象为主，不形成结晶结构，而重链氨基酸序列包含大量GAGAGS 重复片段（G 为甘氨酸，A 为丙氨酸，S 为丝氨酸），这是SF 形成特征β-折叠构象和晶态结构的主要片段［4］。蛛丝蛋白种类繁多，不同的蛛丝蛋白氨基酸序列差别很大，其中重复片段相对少，代表性重复片段主要为连续丙氨酸残基，其结构和性质可参阅文献［9］。在SF基材制备过程中，最核心的分子结构变化是SF分子由无规则、螺旋构象（亦称Silk Ⅰ构象）向β-折叠构象（亦称Silk Ⅱ构象）转变。剪切应力、超声和某些试剂如醇类能加速β-折叠构象转变。β-折叠构象的尺寸、含量、取向和分布等是影响SF 基材力学性能的重要因素。此外，SF 分子量、固含量、水含量等也显著影响其力学性能。SF水凝胶是近年来备受关注的SF基材，其弹性模量范围为数千帕至数兆帕，独特优点是不采用化学交联、仅通过提高SF 浓度至8%以上就能实现高强度［4］。SF材料的体内降解周期为几周至几年，其β-折叠特征是重要影响因素。约95%孔隙率的SF支架可以在大鼠皮下模型4 周内完全吸收［10］，而高强度或高固含量的SF 水凝胶在体内半年内结构稳定吸收很慢。SF 材料中分子相对分子量较高，易形成β-折叠物理交联结构，相比明胶等生物大分子材料体现更优异的力学性能，同时其体内生物相容性优异、降解周期可调，因此宜用作结构性植入物。在免疫反应方面，桑蚕丝无免疫原性，被欧盟认定为非动物制品［1］，其缝线一直是外科手术必备缝线之一。SF 材料会在植入初期引起机体的轻微炎症反应，之后伴随着材料降解，能够实现完整功能性修复［2］。

二、SF软骨修复的生物材料

1. 关节软骨组织的特点：关节软骨是一种特殊的承重组织，在膝关节、髋关节或肩关节处提供无摩擦运动。关节软骨是由透明软骨、钙化软骨和软骨下骨组成，是一个具有不同成分、结构和性质的复合体。透明软骨主要由Ⅱ型胶原、糖胺聚糖和水组成。钙化软骨是介于透明软骨和软骨下骨之间的钙化薄层组织，比邻近的透明软骨更致密，适合传递和分散负荷，同时可阻止血管从软骨下骨层向软骨层迁移，避免软骨层纤维化。软骨下骨具有不同于其他骨组织的独特结构、生物学和力学性质。面向关节软骨修复设计植入物时，应综合考虑透明软骨、钙化软骨和软骨下骨的特性［11］。目前软骨修复与再生的治疗策略包括微骨折、自体软骨细胞移植和异体或自体软骨移植［12］。软骨损伤修复失败会诱发骨关节炎（osteoarthritis，OA），进而导致整个关节功能的退化［13］，这也是OA 临床发病率高的一个重要原因。虽然上述治疗策略在临床上得到了广泛的应用，但仍存在修复效果不理想和供体来源有限等问题。SF 生物材料可以加工成水凝胶、多孔海绵或支架和微载体等，其宏观和微观结构在骨及软骨修复中起到了关键作用。因此，配合临床策略构建理想的SF 生物材料体系，有望实现软骨快速高质量修复并减少诱发OA。

2.SF 水凝胶软骨修复生物材料：SF 水凝胶是通过SF 分子的物理或化学作用形成交联网络负载大量水得到的软材料，模拟了天然细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）的微环境，具有优异的细胞亲和性。Cui 等［14］提出了一种快速细胞相容的光交联工艺，采用辣根酶催化酪氨酸残基共价交联获得了SF 水凝胶，与软骨细胞亲和性极佳，加速了软骨修复。理想的软骨生物材料应与天然软骨的基本力学性能相匹配，还应表现出优异的抗疲劳特性。Huang等［15］用胆固醇或β-环糊精对SF 进行改性，制备的SF 水凝胶具有高机械强度、高韧性和显著抗疲劳性能。

3.SF 支架软骨修复生物材料：SF 支架多孔/海绵也广泛应用于软骨组织工程。相比SF 水凝胶，SF 支架的多孔结构对于小分子的流通性更好，有助于营养物质甚至是细胞的输运；同时，SF 多孔支架能够结合定向、多层和梯度等微结构设计，实现更多功能。Feng 等［16］构建了3 种具有随机孔、径向孔和轴向排列孔结构的SF/胶原复合支架，取向排列孔结构的骨软骨再生效果更好。Yang 等［17］采用温度梯度导引热诱导相分离技术将SF 与去细胞软骨ECM 相结合，制备了具有轴向孔结构的复合支架，促进了软骨的再生。通过功能性涂层修饰SF 支架的稳定表面，可以进一步提高骨软骨的修复效果［18］。微载体也可以认为是凝胶或者支架的一种形式，通过负载药物或因子并控制释放，促进细胞粘附、生长和增殖并促进组织修复。SF 微载体负载TGF-β等软骨特异性生长因子，促进成软骨细胞的归巢、粘附和生长，能够解决损伤部位细胞不足的问题。Galuzzi 等［19］比较了三种不同组分微载体对于软骨细胞的活性，证明SF/海藻酸盐微载体中的软骨细胞活力最高，分泌的ECM最多。

4.SF 软骨修复生物材料的降解性能：植入物材料的降解特性直接影响软骨修复的速度和质量。在植入早期，生物材料要稳定，为细胞和组织提供充足力学支持。在植入后期，生物材料需要逐渐降解以适配新生组织长入［10］。体外试验证明多种蛋白酶都够降解SF 材料，并且SF 材料的降解速率主要由其β-折叠晶区含量决定［20］。另有研究证明冷冻凝胶法制备的物理化学双交联SF 支架的β-折叠晶区尺寸可以被调控，从而获得不同的体内降解速率［21-22］。此外，引入蛋白酶抑制剂等也可以调节SF 材料的降解速率，正如Pritchard 等［23］通过制备了一种掺入蛋白酶抑制剂的SF 支架，通过减缓降解实现了药物的长时间缓释。

三、SF基骨修复生物材料

1. 骨组织的特点：骨组织与软骨等结缔组织不同，其70%的质量来自羟基磷灰石矿物相，胶原蛋白有机质只占30%。骨组织是人体中除牙齿外最坚硬的组织，其压缩模量最高可达20 GPa。人体骨骼的主要功能包括：（1）支撑身体并与肌肉、韧带等组织连成整体；（2）为运动提供支撑；（3）保护重要脏器和组织；（4）为骨髓提供保护，维持造血功能；（5）维持人体矿物质代谢平衡［24］。骨重建是指旧骨的吸收和新骨的沉积，这一过程贯穿生物体的整个生命进程，由成骨细胞和破骨细胞主导，而意外、疾病或老化引起的骨损伤，其修复和再生机制与一般的骨重建不同，免疫机制会主导骨损伤修复过程［25］。当前临床骨损伤的主要治疗手段包括自体骨移植、异体骨移植和人工骨植入。而自体骨的骨源/骨量受限、异体骨可能存在免疫排斥反应。因此，利用组织工程技术和人工骨植入材料修复骨缺损，是骨科临床未来的重要方向［26］。与此同时，寻求安全有效的理想骨植入材料仍面临挑战。

2. 仿生矿化/复合SF 基骨支架：前述不同形态、微观形貌的SF软骨生物材料也可以结合骨组织特异性细胞或者干细胞或者相关药物/生物因子，应用于骨组织工程。早期发现纯SF 支架植入物可以应用于骨缺损修复，并体现优异的再生效果［27］。尽管通过调整纯SF 支架的微观形貌特征、固含量能够提升其力学性能，进而增加与骨细胞和组织相容性，但是，纯SF 支架材料的力学和生物学性能与骨组织相差较远。有研究采用共混、矿化等方式，在组成上采用有机/无机复合，实现对天然骨的成分仿生［28］。通过共混引入羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAp）、生物玻璃等生物矿物相证明了SF 复合体系的模量和强度比纯SF 支架更加适配天然骨组织，并促进骨传导［29-30］。羟基磷灰石纳米颗粒与SF 溶液预先混合会得到被SF 包覆的杂化颗粒，改善了与SF 复合的界面性能，HAp-SF 复合材料的压缩模量达3.2 GPa，成型性能优异，复合材料骨钉在兔骨骨定模型中表现出优异的骨传导效应和新骨生成［31］。最近的研究表明丝蛋白和无机纳米颗粒混杂水凝胶具有可注射性，提供了便于原位修复骨组织的材料［32］。通过矿化方法在SF多孔结构中引入羟基磷灰石促进了体外或体内成骨蛋白和基因的表达［33］，在结合了骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）后，更适合间充质干细胞生长并促进新骨生成［34］。静电纺丝制备的SF微纤无纺布在引入了锂藻土纳米片后，能够有效促进干细胞的吸附和增殖，可应用于骨引导再生术［35］。Guo 等［36］制备梯度硅化SF 与R5 多肽的复合材料，对人骨髓间充质干细胞（human bone mesenchymal stem cells，hBMSCs）在骨诱导环境中的成骨分化具有调控作用。相较多孔SF 支架，通过逐步浇筑干燥的方法制备的SF 树脂十分致密，这种块体SF 基材的力学性能达到了皮质骨的水平，且其机械加工性能优异［37］。目前，SF 树脂被加工成可降解螺钉，用于骨固定，已进入临床试验阶段。该螺钉植入初期稳定降解极慢，1 年后逐渐降解，3年后降解率超过80%。

3.3D制备SF基骨支架：3D制备技术应用于骨组织工程领域取得了长足进展［38］，SF基生物墨水也广泛用于皮肤、软骨和骨组织工程3D 打印中［39］。尽管SF 体系的优点是通过物理交联实现高强度，但SF 物理交联的动力学调控仍然困难，因此3D 打印SF 墨水的挑战之一在于固化成型技术。纯SF 溶液挤出式打印的常见方式是冷冻成型和凝固浴后处理［40］，甲基丙烯酸缩水甘油酯化学改性使SF 墨水具有光交联特性［41］，与透明质酸、明胶共混显著改善了SF墨水打印性能［42-43］。用于骨组织修复的SF 基生物墨水也常复合生物矿物，除了力学和生物学性能的改进，矿物相的引入还赋予SF基生物墨水理想的触变性能，在高剪切速率下易流动、无剪切时易凝固定型［44］。生物墨水负载细胞的3D 打印技术是研究前沿，3D 打印负载细胞的SF 基墨水，细胞存活率达到80%以上，已初步应用于骨组织再生［45-46］。总体来看，3D 制备SF基骨支架代表了目前研发的重要趋势，而优化组成、结构和工艺获得综合性能优异的SF 基3D 结构性材料，同时动物模型试验仍亟待开展。

4. SF 基骨支架的降解性能：SF 生物材料的体外降解研究表明，相同固含量的SF 支架的降解速率慢于SF 水凝胶、快于SF致密膜［1］。基于动物模型的SF基骨支架的体内生物学数据稀少，水溶液体系获得的SF 支架其降解周期为2～6 个月［47］，而新骨生成通常为术后3～6 个月。因此，SF 基骨支架的降解速率需要进一步降低以匹配骨的再生和重塑。

四、展望

骨与软骨修复一直是骨科临床的重要挑战，组织工程技术为这一挑战提供了新的机遇，而生物材料是不可或缺的要素。SF 材料具有优异的力学性能、加工性能和良好的生物相容性，是一种应用前景广阔的生物材料。用于软骨及骨组织修复的SF 材料的前沿研究，体现了SF 材料的多种形态以及搭载基因、药物、生长因子、纳米颗粒和细胞的能力。随着SF 生物材料实现分子结构精准调控和复杂3D 结构定制，更多SF材料在骨软骨组织工程领域的体内应用数据会逐步呈现，SF材料及植入物大规模应用于骨关节临床指日可待。