色谱理论课程教学与应用实例解析

赵志燊,赵 杰,余 磊

(贵阳学院 贵州生态环境中优势农产品残留农药降解关键技术研究重点实验室,贵州 贵阳 550005)

仪器分析一直以来是高校化学实验课程中最为重要的课程之一。它几乎涵盖了环境检测、食品品质与安全、材料合成与应用等基础理论化学和应用化学中相关分析仪器使用的基础理论。[1-4]其所含涵盖的色谱学、光谱学与电化学的技术在近年来突飞猛进。随着国家经济与社会的不断发展,相关行业分析标准对设备的要求也越来越高,包括逐渐提高准入门槛的资质要求等,这无一不体现出该门课程需要与时俱进的重要性。[5]这不仅需要课程在注重“教”的同时更加注重实践教学。操作实验中,结合学生提出疑问、反馈难点,对应重点相结合,归纳出存在难点的实例操作与讲解,科学地开展“教练结合”,打破传统PPT理论或实验视频教学。模式则主要概括为通过讲解—实验—归纳,使学生明显感受仪器操作与理论并重的重要性,并在操作实例中解决理论难点的理解问题。

对此,以色谱理论为例,结合气相色谱与液相色谱不同检测器的分析特点,并应用实际操作实例上样分析。学生在实际读取谱图中与理论相结合,加深对基础理论记忆的同时,并对理论难点进行梳理与运用,解决仅仅通过解题巩固知识的传统教学带来的弊端。在具体到色谱检测器对应的难点上存在同样的问题,且在相关研究中均有不同程度体现。谭芳在气相色谱实验课程教学里,论证了实验课程中改变气相色谱仪检测器、色谱柱的升温程序等条件来让学生操作,并记录在实验报告上,更好地优化色谱条件,充分地理解理论知识。[6]吴泽颖等在色谱教学研究中,发现学生学习色谱知识的主动性、实践能力不高,需要与实际应用如与企业合作教学等方法结合,打破传统老师仅仅教、学生学的模式,提升教学质量。[7]孙艳涛等则在传统气相色谱仪器操作实验中,仅对填充色谱柱与检测器的灵敏度与其他性能进行测定的基础上进行改进;引入作为汽油重要组分二甲苯的3种同分异构体作为实验的目标化合物,3种化合物的物化性质相近,一般的物理与化学方法难以分离鉴定,从而利于学生更好地理解气相色谱仪分析优势与提升仪器分析条件变化的能力。[8]贾琼等就在其仪器分析实验课程设计的相关研究中,指出传统仪器分析实验针对仪器操作的学习较为单一,综合性不强。[9]刘莎莎等则充分利用自己测定野菊花中的龙脑和樟脑的科研成果转化并应用到气相色谱的实验教学,学生自行选择实验条件并优化,分组讨论影响因素,在教研结合的情况下,充分激励学生的学习与科研热情,取得更好的教学效果。[10]通过汇总以上仪器分析中色谱单元应用教学中的难点,不难发现普遍存在理论与实践应用脱节这样的“通病”。

1 学生反映教学难点归纳

结合仪器分析课程班级49名学生,其中男生24名,女生25名,对色谱理论教学色谱理论与检测器构造中存在的难点进行汇总,见表1。表1显示,塔板理论是较多知识点中,反馈人数最多的一点。学生对该知识点的理解较难在于以下两个方面：一是色谱柱在实际的应用中,并不存在塔板,它只是为了表达柱效中的分离效果而引入的概念;二是因为塔板理论在逻辑过程中,对数学的运算能力有一定要求,需要学生具有良好的数学基础。在缺乏实例的情况下,不利于对该理论的理解。在速率理论与分离度知识点上,学生则更为突出反映的是在理解该知识点后,缺乏实例的补充,若仅从书上的附图与相应公式解释,则理解较为空洞。

表1 教学难点汇总

2 教研结合的应用实例

鉴于上述统计,并结合仪器分析实验课程现有的弊端与改革取得的效果。在对应气相色谱理论与运用教学中,笔者采用教研结合的方式,对环境分析中普遍存在的典型持久性有机污染物,包括美国环保署优先控制的16种多环芳烃以及21种典型有机氯农药,作为教学目标化合物,通过不同的升温程序、检测器、不同基质,作为结果比较与讨论的优化项目。打破传统单一固定的较少化合物实验模式,总结并综合全面的教研结合课程模式。16种多环芳烃与21种有机氯农药见表2所示。

表2 应用于教学的16种多环芳烃与21种有机氯农药

对于烃类物质,在气相色谱教学设计中,主要应用氢火焰离子化检测器(Flame Ionization Detector,FID)来进行检测,但对于某些同分异构体,其物化性质非常接近,则难以分离。在此基础上,引入液相色谱仪(Liquid chromatograph,LC)、质谱检测器(Mass Spectrometry,MS)检测。介绍LC相对于GC的不同,MS相对于FID的优势。对典型有机氯农药采用电子捕获检测器(Electron Capture Detector,ECD)检测,对其在绿茶基质提取液中出现峰漂移现象,介绍出现故障的可能原因与维修方法。

图1为16种多环芳烃以正己烷为溶剂的标准品,苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽截取色谱图。使用FID检测出峰时间段的升温速率分别为2.5 ℃/min、1 ℃/min和0.5 ℃/min,以代表常规、较慢与慢速3种不同升温速率所得色谱图。运用在教学中,讲解升温速率对分离效果影响的理论。但鉴于在大量教学理论与案例中已有讲解,此处以升温速率改变对同分异构化合物分离效果影响较小的特例介绍,同时比较其他检测器与不同色谱检测模式优劣性,做到教学难点重点结合与模式创新。

气相色谱仪升温过程中采用岛津GC-2014C色谱仪,配备FID,载气为氮气,色谱柱采用美国安捷伦型号DB-5,规格为30 m×0.25 mm×0.25 μm。常规升温速率程序为：“气化室温度250 ℃,检测器温度300 ℃;色谱柱初始温度为80 ℃,以15 ℃/min的升温速率,达245 ℃;以10 ℃/min的速率升温到255 ℃并保留1min;再以1 ℃/min的速率升温到265 ℃并保留1min,最后以2.5 ℃/min升高到295 ℃并保留2min”。图1A显示同分异构体苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽难以有效分离。此时的苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽出峰时间处于色谱柱以2.5 ℃/min升高到295 ℃的时间段内,色谱柱升温到270 ℃以上后,开始出峰。为达到符合要求的分离效果,将对应出峰时间段的升温速率降低,在之前方法基础上,270 ℃～280 ℃升温段内,采用1 ℃/min的较慢升温速率,出峰结果见图1B。图1B显示,在改变升温速率后,苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽依旧难以有效分离,不能定性与定量分析。最后,采用0.5 ℃/min的慢速升温速率,出峰结果见图1C。图1C分离效果甚至低于图1B,有出现3个色谱峰重叠的可能,仍不能满足定性与定量的要求。

图1A 常规升温速率苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽气相色谱图

图1B 较慢升温速率苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽气相色谱图

图1C 慢速升温速率苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽气相色谱图

气相色谱仪升温速率对分离度影响的理论中,升温速率在恒压控制下,与载气在柱中流速的比值与分离度成反比。[12]上述案例验证,载气流速相同条件下,降低升温速率,比值变小,则分离度应该增大。但对于某些特殊的同分异构体,如苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽依旧难以显著改善分离度,以达到定性与定量的要求。该实例所得的色谱图与张茂升等的研究中存在同等化合物不能有效分离的现象,结论一致。[11]对此,引入采用液相色谱仪配备紫外检测器对应16种PAHs的检测,从而比较两者之间的不同之处。LC与GC的不同之处在于具有高沸点、大分子,热稳定性差的化合物,LC比GC更合适。苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽对应沸点分别为481 ℃与480 ℃,均高于300 ℃。采用液相色谱仪检测多环芳烃,二极管阵列串联荧光检测器、紫外检测器均可检测,此处介绍2种检测器的原理与不同之处。在实例中,以岛津LC-16配备紫外检测器,色谱柱采用C18反相分析柱,型号：Athena PAHs HPLC Column,规格：25 cm×4.6 mm×5 μm,以乙腈与超纯水作为流动相进行检测。对应16种PAHs中苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽截取色谱图谱见图2。图2显示2种化合物的分离效果明显优于气相色谱分析法,虽然仍有连峰现象,但总体分离效果较好,分离度达到基本定性与定量要求。

图2 苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽液相色谱图

苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽的特殊性在比较两种不同色谱分析模式的优劣后,更深一步地引入质谱分析原理及联用优势。在此基础上,引入总离子流色谱图、离子峰、电子电离源等概念。电子电离源在固定70 V电压的条件下,对化合物建立的标准谱库,更有利于化合物的分析与检索。该实例中,以美国安捷伦型号为8890-7000D,气相色谱三重四级杆质谱仪,采用单四级杆模式,色谱柱为美国安捷伦型号：DB-5MS,规格：30 m×0.25 mm×0.25 μm。图3A为苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽的总离子流色谱图,其分离度较GC-FID有所提高,但并不优于LC的分离度。但此处因为有了谱库可作为参比依据,以不同化合物的质谱图作为定性依据,则相对于单色谱而言,更加复杂基质的提取液分析也提供了更为精准的保证。图3B与3C分别为苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽的质谱图。在两张质谱图的差异中,更好地定性苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽。

图3A 苯并(b)荧蒽与苯并(k)荧蒽总离子流色谱图

图3B 苯并(b)荧蒽质谱图

图3C 苯并(k)荧蒽质谱图

在教研结合的教学中,还有一个重要环节,针对仪器操作中出现的故障,进行实例讲解。此处引入色谱实验教学实例中色谱峰漂移的原因,包括载气受到波动,引起流速变化;长时间进样引起色谱柱污染与载气被污染等因素并有效结合理论进行阐述。设备采用岛津GC-2014C配备ECD,色谱柱采用美国安捷伦型号DB-1701,规格为30 m×0.25mm×0.25 μm。对应21种有机氯农药标准样品,在绿茶基质提取液中的色谱图与纯标准品的对比色谱图见图4。图4A为21种有机氯农药标准溶液色谱图,图4B为进样两周后,色谱柱接进样口端受到污染,发生基质提取液出峰滞后漂移现象,不利于准确定性。通过陶瓷切割片,切割受污染部分色谱柱,截取长度为20 cm;并以300 ℃老化色谱柱4 h。图4C中为截取受污染色谱柱,并老化后的色谱对比图。此时,21种有机氯农药绿茶基质提取液与纯有机氯农药标准品对应出峰时间重叠图,未发生峰漂移现象,可用于定性定量。

图4A 21种有机氯农药标准溶液气相色谱图

图4B 受污染色谱柱21种有机氯农药对比色谱图 (注：黑线为标准色谱峰,蓝线为绿茶基质提取液。)

图4C 干净色谱柱21种有机氯农药对比色谱图 (注：黑线为标准色谱峰,红线为绿茶基质提取液。)

3 结论

通过对16种多环芳烃的不同检测,对色谱理论、方式与检测器类型的实例讲解,并对21种有机氯农药在绿茶基质检测过程中出现峰漂移现象所产生的故障原因进行分析与溯源。存在相关知识点疑惑的学生人数由讲解与操作之前的8-12人降至3-5人,对教学成果的优化率显著提高。