被子植物种子发育的激素调控研究进展

朱小洁 王雯 于倩倩 耿雅婷 朱沂昕 刘立科

(聊城大学生命科学学院，山东 聊城 252059)

种子是被子植物在复杂环境中生存和延续的关键，植物种子的异常发育可能会导致后代的生长繁殖受阻，同时种子的发育程度也决定着大多数农作物的产量。胚胎、胚乳和种皮的发育是种子的主要组成部分，决定了籽粒的生长发育，虽然这3个主要部分表现出不同的形态和功能，但必须协调生长才能实现种子的正常发育，这一过程由多种调控途径共同作用，构成复杂的基因表达调控网络。

在先前的研究中，确定了几种影响种子发育的信号通路，包括IKU通路、泛素-蛋白酶体通路、G蛋白信号通路和MAPK信号通路[1]。在多种信号调控途径中，植物激素同样在种子发育调控中起重要作用，生长素、细胞分裂素、油菜素内酯和赤霉素是控制种子发育的关键成分，也成为当前种子发育调控的研究热点。本文以这4类植物激素的生物合成及激素信号转导过程为主，总结激素传导通路上影响种子发育的调控基因及激素间互作关系，这些内容将有助于未来在作物研究中进行反向遗传实验的基因选择，推动种子发育研究的进一步发展。

1 生长素

1.1 生长素在种子发育过程中的功能

生长素(Auxin)简称IAA，是调控种子发育过程的主要激素，并存在于种子发育的所有阶段，从受精开始到种子成熟都保持着高水平积累，调控受精后胚胎、胚乳和种皮的发育。生长素在胚胎发生早期通过影响胚体的顶基极性，以浓度依赖的方式驱动生长和发育，在胚的形成中起重要作用，因此生长素也成为众多植物激素中对种子发育影响最大的植物激素，生长素信号通路如图1所示。

图1 生长素信号通路

1.2 生长素调控基因

1.2.1 IAA的运输

生长素外排载体PINs和内流载体AUX/LAX介导了种子发育过程中生长素的主动运输，是调节生长素极性运输的重要蛋白。目前已知LAX1、LAX2和LAX3参与生长素细胞内流，Robert等[2]在甘蓝型油菜小孢子胚和拟南芥合子胚中，证明了AUX1、LAX1和LAX2是芽和根形成所必需的调控因子。生长素外流载体PIN3和内流载体AUX1参与生长素的极性分布，PIN3表达于被膜最内层，AUX1在胚乳和外被层均有表达，介导种皮中生长素的极性运输[3]，ENP(PINOID增强子)也可以通过与PID(PINOID蛋白激酶)一起控制PIN1的极性特异性来调节子叶发育[4]。这些载体的细胞定位表明了生长素的流向，从而形成了生长素的浓度梯度，控制生长素运输的平衡。

1.2.2 IAA生物合成

生长素的主要来源是生物合成，色氨酸(L-TrP)和吲哚-3-丙酮酸(IPyA)共同介导IAA的生物合成。YUCCA(YUCs)类基因编码含黄素单氧化酶，与IPyA协同作用下控制IAA的生物合成。在玉米中，ZmYuc1基因编码玉米胚乳特异性YUCCA1蛋白，其基因缺失突变体de18的IAA生物合成受损，导致胚乳增殖缺陷，使种子变小[5]。在进一步研究中发现，RGB1基因的下调显著降低生长素含量，延缓籽粒发育，降低了淀粉积累和籽粒重，OsNFYB1作为RGB1的关键下游效应因子，直接与OsYUC11的启动子相互作用，刺激OsYUC11的表达，从而调控生长素的生物合成[6]。总的来说，YUCs成员通过动态表达调控种子局部生长素的生物合成来调控种子发育，但生长素调节机制却大多都集中在YUCs调控环节上，TAA调控生长素合成的基因还未有过多报道。

1.2.3 ARF相关基因

ARF是调节生长素应答基因表达的转录因子，具有识别下游基因启动子区域内的生长素反应元件并调节其表达的能力。生长素反应因子ARF2是ARF转录因子家族成员，MNT编码的ARF2是细胞分裂和器官生长的抑制因子，拟南芥功能缺失突变体mnt的种子与野生型相比大小和重量都有所增加[7]。过表达microRNA167A可以降低亚麻荠中α-亚麻酸含量，还可以通过靶向作用于ARF6和ARF8来调节胚胎和胚乳的发育，使种子增大[8]。在甘蓝型油菜的9号染色体上还发现了另一个数量性状位点ARF18，其编码生长素反应因子，在角果发育过程中调节细胞壁的细胞生长，从而影响种子质量[9]。综上所述，一旦ARF的表达出现被抑制或被激活，其相应的生长素反应基因也会被激活或去抑制。

2 细胞分裂素

2.1 细胞分裂素功能在种子发育过程中的功能

细胞分裂素(Cytokinin，CK)的主要功能为促进细胞分裂，影响细胞周期，主要作用于种子发育初始阶段。在胚珠的形成阶段，CK信号增强可以促进细胞分裂，产生更多的胚珠，胚珠的形成也是影响种子产量的关键，发育初始阶段CK合成相关基因的高表达可提高种子数量[10]。种子的发育与胚和胚乳中CK水平的升高密不可分，CK信号通路如图2所示。

图2 细胞分裂素信号通路

2.2 细胞分裂素相关调控基因

2.2.1 CK的合成与分解

IPTs(异戊烯基转移酶)和LOGs(细胞分裂素核苷5′-单磷酸盐磷酸核糖水解酶)是参与CK合成的关键酶，植物中CK含量的多少可以直接调节种子发育的过程，因此控制CK合成与分解的过程尤为重要。TMO5/LHW通过LOG4控制CK生物合成，因此，TMO5是生长素的直接反应基因，TMO5的表达标志着球形胚胎时期细胞的建立[11]。拟南芥中，AtENO2编码的蛋白AtENO2和AtMBP-1与AtbZIP75相互作用，控制种子中的CK的含量，而AtENO2功能的缺失导致了与烯醇化酶活性降低相关的发育缺陷，其突变体降低了CK的含量，与野生型植株相比，AtENO2突变体种子中葡萄糖含量显著升高，淀粉含量显著降低，导致子叶变小，种子的大小和重量减小[12]。

CK的分解由CKXs(细胞分裂素氧化酶/脱氢酶)催化，CKXs可使具有生物活性的CK失活，是植物内源CK的负调控因子。如，来自拟南芥的CKX3，CKX5基因可直接分解细胞分裂素，ckx3-ckx5功能缺失双突变体可以进一步验证CKX的分解作用，该突变体中活性CK的升高使拟南芥形成较大的花序和花分生组织，证明CKX3和CKX5可调控生殖分生组织的活性[13]。另一个负调控因子CKX2可启动籽粒大小，Tsago等[14]在水稻Osckx2-2突变体中可以得到相似的结论，OsCKX2-2基因与野生型相比表达量更低，CKX活性的降低，使其籽粒相比于野生型更长、更宽、更重。

2.2.2 CK受体相关

CK信号由细胞膜上的HK(组氨酸激酶)感知，HK5和HK6作为细胞分裂素受体，可调节水稻生长发育的各个方面，在水稻hk5和hk6单突变体中，其根生长、叶宽、花序结构和花发育会受到影响，在hk5-hk6双突变体中表现出更严重的缺陷[15]。HK受体的缺失导致CK无法在细胞膜上被特异性识别，胞内也无法进行下一步蛋白磷酸化级联反应。

2.2.3 CK反应调节因子

细胞核内，CK信号通路涉及1个B型反应调节因子(RRB，在拟南芥中称为ARR-B)和1个A型反应调节因子(RRA，拟南芥中称为ARR-A)，其中，ARR-B是调控CK应答基因表达的转录因子，调控基因的转录及表达。研究发现，B型ARR功能缺失的三突变体arr1，10，12表现出生殖缺陷，雌蕊和花长较短，胚珠较少的性状，导致拟南芥种子数量减少[16]，这证明了B型ARR是CK信号转到中的重要环节，大多学者报道了其在CK信号通路上的功能，但近些年对调控B型ARR的遗传因子还未有更深入的研究。

3 油菜素内酯

3.1 油菜素内酯在种子发育过程中的功能

油菜素内酯(Brassinolide，BR)作为主要的植物激素之一，对植物正常生长、发育和适应生物和非生物胁迫的各种过程至关重要，参与一系列的生理过程。在种子发育过程中，可以调节胚珠数及花粉发育，其中最重要的功能是BR可以使种子粒宽、粒长等形态特征发生改变，对控制种子的形状有重要作用[17，18]，BR信号通路如图3所示。

图3 油菜素内酯信号通路

3.2 BR参与种子发育的调控基因

3.2.1 BR生物合成

BR以剂量依赖的方式控制植物的生长发育，因此种子中BR的生物合成至关重要。小麦中同样发现了编码BR生物合成酶的TaD11基因，该基因在根和籽粒中高表达，而外源BR可显著抑制其表达，TaD11-2A基因缺失突变体tad11-2a-1内源BR含量降低，表现为矮化和小种子[19]。此外，在水稻中利用种子特异表达启动子驱动BR合成关键酶基因OsDWF4的表达也可以显著提高水稻粒长和单株粒数[18]。综上所述，可以看出D11是BR合成过程中极其重要的调控因子，BR的合成可直接影响种子发育，造成种子形状的改变。

3.2.2 BR受体相关

BRI1(BR受体激酶)是一种质膜富亮氨酸重复体样激酶，也是拟南芥的主要BR结合受体，BRI1作为BR信号的结合受体，是BR胞内信号转导的第1步。Jaiswal等[20]研究发现，携带突变基因BRI1的116、144和168号大麦育种品系的粒级分布发生了变化，其中最大直径发生了显著变化，但直链淀粉浓度差异不显著，BRI1突变还改变了B型和C型小淀粉颗粒的支链淀粉精细结构，导致携带BRI-1突变的基因型中A型葡聚糖短链的比例增加(<10DP)，B2链的比例减少(25-36DP)。这证明了BRI1在种子发育中的重要性，异常的BRI1会延迟籽粒发育、直链淀粉合成和淀粉在胚乳中的积累，籽粒发育的延迟可导致作物产量的增加，可以猜测其籽粒形态的改变是因胚乳中淀粉颗粒的支链淀粉精细结构的改变而改变的。

3.2.3 BZR1相关基因

BR通过一系列磷酸化级联反应，利用PP2A(蛋白磷酸酯酶2A)使BZR1/BES1去磷酸化，并与14-3-3蛋白解离，使BZR1/BES1聚集在细胞核内，诱导下游调控植物种子生长发育过程中多种基因的表达。

OsBZR1与BR合成基因D11相似，BR信号感知因子OsBZR1的过表达可直接促进CSA的表达，从而触发花粉和种子发育过程中糖分配和代谢基因的表达，导致花药和种子中的糖分积累量的增加，进提高籽粒产量[21]。而OsBZR1又与OFP1启动子相关联，OFP1通过高BR信号参与抑制植物生长，因此，OFP1过表达也会导致籽粒形状的改变[17]。GW5也是一种BR信号正调控因子，在水稻各器官中均有表达，幼嫩穗中表达量最高，影响水稻籽粒宽度和籽粒重量，GW5蛋白可与拟南芥GSK2(糖原合成酶激酶2)相互作用，抑制GSK2的活性，使未磷酸化的OsBZR1蛋白在细胞核中积累，从而介导BR应答基因表达和生长应答[22]，GW5缺失型水稻品种的籽型发生改变，有着较短的粒长、较宽的粒宽、较厚的粒厚、较小的长宽比和较重的千粒质量[23]。

4 赤霉素

4.1 赤霉素在种子发育过程中的功能

赤霉素(Gibberellin，GA)最早发现于20世纪初，与脱落酸(Abscisic acid，ABA)在植物体内相互作用，是拮抗调节种子发育和萌发的主要激素，也是胚胎发育的负调控因子。在胚胎分化阶段，可促进细胞生长和膨胀，同时控制籽粒灌浆过程中胚乳细胞的伸长和分裂[24]，GA信号通路如图4所示。

图4 赤霉素信号通路

4.2 GA相关调控基因

4.2.1 GA的生物合成

GA生物合成的后期，GA生物活性的水平主要由3种酶控制，GA20ox和GA3ox催化中间产物转化为具有生物活性的赤霉素，另一种酶GA2ox，催化有生物活性的GA转化为无活性的分解代谢产物，研究发现，这3种酶可以依据GA浓度在细胞内动态调节活性GA的生物合成，控制种子发育。

GA20ox基因编码GA合成途径中的关键酶GA20ox，可使无活性的GA催化生成有活性的GA，过表达GA20oX提高了转基因植物种子的大小，即GA20ox可以通过影响赤霉素的生物合成而正向调控大豆种子大小[25]。GA3ox是大豆赤霉素合成途径的另一个关键酶，GmGA3ox1基因编码该酶，敲除GmGA3ox1可导致许多光合作用相关基因的上调，虽然减少了赤霉素的生物合成，但促进了大豆的光合作用，可在总体上提高种子产量[26]。而GA2ox与GA20ox、GA3ox催化作用相反，可使胚乳中有生物活性的GA失活，拟南芥种子中，在MEDEA启动子的控制下，过表达PsGA2ox基因可导致种子流产和抑制花粉管的生长[27]。综上所述，GA含量的适当减少可以在一定程度上提升作物产量，但GA含量过少会导致种子发育缺陷，证明胚乳中活跃的GAs对种子的正常发育至关重要。

4.2.2 GA受体相关

赤霉素受体GID1感知到有生物活性的GA时，植物中的GA信号开始细胞内传导。GID1A，GID1B和GID1C为3个GA受体基因，GID1A在整个雌蕊中表达，在坐果和生长过程中起主要作用；GID1B在胚珠中表达，种子发育中起作用；GID1C在瓣中表达，可调控荚果的伸长，其三突变体表现出比极端GA缺乏突变体更严重的矮化表型，发育迟缓，花的形成时间较长且花器官发育缺陷严重[28]。杨晓颖等[29]对水稻中另一个GA受体基因OsGRL1的功能进行了探究，发现与GID1不同，OsGRL1定位于细胞膜上而非细胞核中，且不受外源GA的诱导，这可能是不同于GID1的调节机制，OsGRL1基因突变使GA信号转导通路中抑制基因SLR1的表达下调，提高了突变体对GA敏感性，体表现出穗颈伸长、籽粒变小和千粒重降低的表型。这些证明了受体基因在GA信号转导中的重要程度，相关基因的低表达会造成种子生长发育缺陷。

4.2.3 DELLA蛋白相关基因

当GA与GID1结合后进入细胞核内，GA信号通路以DELLAs为中心，可抑制GA依赖的生物过程，是GA信号的负调控因子，E3泛素连接酶参与GA感知和信号转导，通过泛素26S蛋白酶体途径降解DELLAs。拟南芥TaGW2-6A可编码RINGE3泛素连接酶，因此NIL31(TaGW2-6A等位基因变异)中GA生物合成和应答基因的表达量更高，导致GASA4的高表达，通过GA激素途径控制籽粒灌浆过程中胚乳细胞的伸长和分裂[24]。

5 植物激素间的相互作用

5.1 GA信号通路中DELLA蛋白介导的激素互作

GA在一些花的形成过程中有负调控作用，BR可以在番茄胚珠形成过程中下调赤霉素合成的关键蛋白基因GA20ox1，在该过程中对GA的生物合成起反向作用，降低有活性GA水平，减少DELLA蛋白的降解，BR通过这种方式稳定DELLA蛋白，使胚珠原基形成[30]。DELLA可与BR信号转导中的BZR1/BES1相互作用，而且对BZR1的转录活性也有抑制作用，BR信号通过促进BZR1与DELLA相互作用来增强GA信号传导，从而减轻DELLA对GA介导的生长的抑制，建立了DELLAs作为BR和GA之间信号串扰的介质，控制细胞伸长和调节植物生长[31]。

GA和ABA作为拮抗剂，拮抗调节种子发育和萌发，DELLA，ABI3和ABI5形成蛋白复合物，可以激活种子萌发的关键抑制因子SOM基因的表达，共同介导GA和ABA信号，激活ABA生物合成并抑制GA生物合成[32]。

5.2 IAA相关的激素互作

在植物体内，IAA与CK相互作用，TMO5是生长素直接反应基因，LOG4是编码CK生物合成过程中的关键酶，而LOG4又是TMO5/LHW的直接靶基因，生长素作用于TMO5/LHW后，通过LOG4控制CK生物合成，因此CK可被生长素诱导[11]。此外，TAA1和PIN3可被CK及转录因子SPT激活，SPT及CK可能共同促进编码TAA1和PIN3基因的表达，从而产生对雌蕊生长非常重要的生长素[16]。

生长素信号通路的缺陷可导致种子萌发过程中ABA修饰的敏感性，ABI4和ABI5是生长素介导的抑制种子萌发的重要调节因子，因此ABA抑制生长素介导的种子萌发[33]。

5.3 BR相关的激素互作

BR和ABA信号通路之间存在复杂的相互作用，Li等[34]证明ABA通过诱导BR合成调控基因OsGSR1的表达来激活BR合成，且ABA仅依赖于ABA信号核心转录因子ABI3调控OsGSR1表达，这证明了ABA与BR之间协同交互作用的存在，并揭示了这一协同作用部分依赖ABI3-OsGSR1模块的分子机制。

CK还可以上调BR生物合成(DFW4)和信号转导(BRI1、BAK1)基因，BR上调IPT，IPT是生物活性CK生物合成的主要酶[35]，同时增加BR和CK含量能提高胚珠数和种子数，BR和CK在种子发育中表现出正交互作用，这表明BR-CK串扰可能有助于改变源/库关系，提高作物产量和胁迫响应。

5.4 ET相关的激素互作

乙烯(Ethylene，ET)是一种气体植物激素，对拟南芥种子萌发具有拮抗作用，而对GA具有协同作用。在萌发过程中，ABA和GA处理对乙烯生物合成的影响主要是通过改变ACO的表达，进而影响乙烯的生物合成，在乙烯生物合成突变体aco2中，由于ACO缺乏，ET的产生受到影响[36]。研究发现，BR也可能通过诱导拟南芥ACS5基因表达来调节乙烯生物合成，BR通过增加ACS5的稳定性来发挥转录后作用，BR受体BRI1激活BR信号，以剂量依赖的方式控制乙烯生物合成[37]。

从上述激素间的互作关系可以看出，多种激素通过激素信号通路间的互作控制着有关种子多方面的生长发育，还可以影响其他激素的合成和敏感性，综合上述调控种子发育的植物激素互作关系，绘制出了激素间的调控网络，如图5所示。

图5 涉及种子发育的植物激素互作调控网络

6 展望

提高作物产量一直是农业育种中的一个重要目标，根据以上对种子发育的分子机制和调控网络的理解，可以使用农艺干预、分子标记辅助选择及CRISPR/Cas9基因编辑技术等方法，筛选出具有所需改良性状种子的作物。在此基础上，先导编辑(Prime Editing)是近年来发展起来的一种新型CRISPR/Cas衍生的精密基因组编辑技术，其可以在目标位置引入任何碱基转换[38]，这项技术未来在作物育种上还有很大的应用潜力。

许多国内外学者已经发现很多参与植物激素代谢途径的调控基因，认识到了种子的发育过程绝不是单一激素的作用结果，因此对于激素互作的调控网络还待继续发掘。此外，在已有的研究中，大多调控基因都参与胚胎及胚乳的发育，而通过种皮影响种子发育形态的调控因子远没有胚胎及胚乳多，且发掘的大多是与作物产量性状相关的遗传因子，未来在满足产量的基础上，可以将更多的目光投入到提升种子营养的方向上，这将有助于对种子发育的分子机制展开更深入的研究。