HPLC与UPLC-MS/MS测定FAPAS液体维生素补充剂能力验证样品中的维生素B1

杨 黎，文 丽，韦春梦，江秋霞，刘 星

（1.广西-东盟食品检验检测中心，广西 南宁 530025；2.广西壮族自治区食品药品检验所，广西 南宁 530021）

维生素B1又称硫胺素，具有维持人体正常糖代谢的作用，是糖类代谢酶的组成成分[1]，在人体内不能合成，需通过外界间接获取或直接补充[2-3]，常作为添加剂制成保健食品。为验证实验室检测保健食品中维生素B1的能力，我们参加了此次英国FAPAS（Food Analysis Performance Assessment Scheme）分析实验室能力验证工作。

维生素B1的检测技术报道较多，主要包括紫外-可见分光光度法[4-5]、高效液相色谱（HPLC）-紫外检测法[6-8]、HPLC-荧光检测法[9]、HPLC-质谱（MS）联用方法[10-11]等。本研究试验对象是FAPAS国际能力验证样品，不指定检验方法。目前国内检测维生素B1的标准主要有GB/T 5009.197-2003《保健食品中盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺和咖啡因的测定》[6]，GB 5009.84-2016《食品安全国家标准 食品中维生素B1的测定》[9]。基于样品分析国标检测方法，GB/T 5009.197-2003直接用甲醇-水-磷酸混合溶液稀释样品后进行检测，无水解和酶解过程，如样品中含结合态维生素B1有可能提取不完全；GB 5009.84-2016第一法HPLC法需衍生后用荧光检测器进行检测，实验过程长且衍生化合物稳定时间短，当有其他荧光物质干扰时可能影响检测准确性；而质谱检测器在灵敏性、准确度和选择性等方面具有明显优势。综上，在国标的基础上优化了前处理方法，同时采用HPLC-紫外检测和超高效液相色谱-质谱/质谱（UPLC-MS/MS）两种方法进行检测，并比较结果。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters 2890高效液相色谱仪（带DAD检测器，美国Waters公司）；Waters H-CLASS/XEVO TQD三重四极杆液质联用仪（美国Waters公司）；X3R高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher公司）；Milli-Q超纯水机（美国密理博公司）；Mettler Toledo XS205DU电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；S300H超声波清洗器（德国Elmasonic公司）。

1.2 材料

液体维生素补充剂样品（由FAPAS实验室提供），样品冷藏存放，测试前按作业指导书放置到常温并充分摇匀。维生素B1标准物质（纯度：98.6 %，CAS：67-03-8，BePure公司，使用前105 ℃干燥4 h）；硫酸月桂酯钠，正丁醇，甲醇，乙腈（色谱纯，德国默克公司）；铁氰化钾，氢氧化钠，盐酸，乙酸钠，冰乙酸（分析纯，广东光华）；木瓜蛋白酶（德国默克公司，酶活力≥1500 U/mg）；淀粉酶（德国默克公司，酶活力≥3700 U/g）；超纯水（电阻率：18.2 MΩ·cm）。

2 方法

2.1 HPLC

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Atlantis T3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：1 %硫酸月桂酯钠（含0.1 %磷酸）溶液:乙腈=58:42；流速1.0 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：260 nm；进样量：10 μl；等度洗脱。

2.1.2 标准溶液的配制 精密称取25 mg维生素B1标准物质，置于25 ml量瓶中，加水溶解，定容，摇匀，配制质量浓度为1 mg/ml的标准储备溶液。然后以甲醇-水-磷酸（100:400:0.5）为溶剂，配制维生素B1质量浓度分别为0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/ml的标准系列工作溶液。

2.1.3 供试液的制备 称取1.00 g摇匀的试样，置于100 ml具塞三角瓶中，加入0.1 mol/L盐酸溶液60 ml，充分摇匀，塞上软质塞子，高压灭菌锅中121 ℃保持30 min进行水解，水解结束，冷却至40 ℃以下，取出，轻摇数次；然后用2.0 mol/L乙酸钠溶液调节pH至4.0，加入混合酶溶液2.0 ml，摇匀，置于培养箱中37 ℃过夜酶解（酶解时间16 h）。将酶解液全部转移至100 ml量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，离心，0.45 μm滤膜过滤，待进样。

2.1.4 加标回收试验 称取1.00 g样品，加入一定量的维生素B1标准溶液，按2.1.3项下方法处理，测定回收率，计算相对标准偏差（RSD）。

2.2 UPLC-MS/MS

2.2.1 色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相：A为0.2 %甲酸水溶液，B为甲醇；流速：0.3 ml/min；柱温：30 ℃；梯度洗脱程序：0～1 min，100 %A，1～3 min，100 %A～5 %A，3～5 min，5 %A～50 %A，5～6 min，50 %A，6～7 min，50 %A～100 %A，7～11 min，100 %A；进样量：4 μl。

2.2.2 质谱条件 采用ESI源；正离子模式，多反应监测（MRM）；毛细管电压：1.2 kV，离子源温度：150 ℃，脱溶剂温度：500 ℃，脱溶剂气流速：1000 L/h，锥孔气流速：150 L/h，碰撞气（氩气）流速：0.15 ml/min。

2.2.3 标准溶液的配制 精密称取25 mg维生素B1标准物质，置于25 ml量瓶中，加0.01 mol/L盐酸溶液溶解并定容，摇匀，配制质量浓度为1.0 mg/ml的标准储备溶液。准确移取1.00 ml标准储备液，用水稀释并定容至100 ml，摇匀，配制质量浓度为10.0 μg/ml的标准中间液，临用现配。然后吸取一定量的标准中间液，配制维生素B1质量浓度为10，50，75，100，200 ng/ml的标准系列工作溶液。

2.2.4 供试品溶液的制备 精密吸取2.1.3项下供试品溶液2.0 ml至10 ml量瓶，加水定容，0.22 μm滤膜过滤，待进样。

3 结果与讨论

3.1 HPLC流动相的优化

首先参照标准GB/T 5009.197-2003[6]，使用流动相硫酸月桂酯钠溶液（5 g→530 ml）-乙腈-磷酸（530:470:1），结果采用此流动相，维生素B1色谱峰峰展宽且吸收响应低；更换流动相比例，流动相改为1 %硫酸月桂酯钠（含0.1 %磷酸）溶液-乙腈（58:42），增加水相比例后的色谱峰峰形对称，响应值显著提高，且目标化合物附近没有干扰峰，见图1。

图1 标准溶液和供试品溶液色谱图

3.2 UPLC-MS/MS质谱条件优化

在ESI正、负离子模式下，对维生素B1标准溶液（浓度100 ng/ml）进行母离子扫描，维生素B1在正离子模式下质谱信号强，确定正离子模式扫描；然后在子离子扫描模式下，通过施加一定碰撞能量，使维生素B1母离子碎裂产生子离子，获取子离子信息，并对毛细管电压、离子源温度、脱溶剂温度、脱溶剂气流速、锥孔气流速、碰撞气（氩气）流速、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数进行了优化，以强度最大的子离子作为定量离子，以强度稍小的子离子作为定性离子。优化后的质谱检测参数见表1。

表1 目标化合物的质谱参数

3.3 UPLC-MS/MS色谱条件优化

维生素B1是极性较强的化合物，在一般的C18反相色谱柱上的保留能力差，HPLC中使用的离子对试剂不适合质谱检测系统。本方法选择对极性化合物的保留显著增强的HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），使维生素B1得到了有效的保留和分离，提取离子色谱图见图2。

图2 维生素B1的MRM色谱图

3.4 标准曲线

将标准工作溶液按优化后的色谱条件进样分析，以质量浓度为横坐标，峰响应值为纵坐标绘制标准曲线，见表2。结果表明，两种方法的线性关系均良好。

表2 两种方法的线性参数表

3.5 样品检测方法的选择

样品为国际能力验证样品，未指定检验方法，分析现行国标检测方法：GB/T 5009.197-2003直接用甲醇-水-磷酸混合溶液稀释样品后进行检测，无水解和酶解过程，如果样品中含结合态维生素B1，可能提取不完全；GB 5009.84-2016第一法HPLC法样品溶液需衍生后用荧光检测器进行检测，实验过程长且衍生化合物稳定时间短，当有其他荧光物质干扰时可能影响检测准确性；液相色谱-紫外检测器检测样品中维生素B1不需要进行衍生，实验过程简便快捷，质谱检测器在灵敏性、准确度和选择性等方面具有明显优势，能对目标化合物进行准确定性。综上，在国标方法的基础上优化了前处理方法，参照GB 5009.84-2016《食品安全国家标准 食品中维生素B1的测定》[9]中试液提取方法进行样品提取，舍弃后续衍生后用荧光检测器进行检测的方法，采用HPLC-紫外检测和UPLC-MS/MS两种方法进行检测，两种方法的测试结果见表3。由表3可见，两种方法的检测结果无显著差异。

表3 两种方法样品中维生素B1的含量检测结果（n=4）

3.6 加样回收率

为了验证两种方法的准确性，进行了加样回收率的测定，结果见表4。HPLC加标回收率为97.48 %～99.55 %，RSD为0.9 %，UPLC-MS/MS加标回收率为100.43 %～104.33 %，RSD为1.8 %，结果见表4。由表4可见，两种方法加样回收率高，精密度好，表明选择的方法准确、可靠。

表4 两种检测方法加样回收率考察结果（n=4）

3.7 结果上报

按上述结果，最后上报两法的平均值7.49 mg/100 g。本次FAPAS比对，共30个实验室提交维生素B1的数据，30个数据的中位值为7.74 mg/100 g，上报的数据Z值为-0.4，结果为“满意”（“满意”要求∣Z∣≤2），表明本文方法科学、可靠。

4 结论

本研究建立了HPLC和UPLC-MS/MS法同时测定FAPAS液体维生素补充剂能力验证样品中维生素补品中的维生素B1含量，最后上报数值获得“满意”结果。方法对现行国标做了一定创新和改进，经过验证结果准确可靠，具有一定的应用推广价值。