高效液相色谱-串联质谱法测定牛组织中马波沙星残留方法的研究

贾兴，黄凯，李红园★，耿智霞，瞿红颖，刘静，宋婷婷，邓彦宏

（1.河北远征药业有限公司，河北石家庄 050041；2.河北省兽药技术创新中心，河北石家庄 050041；3.石家庄市兽药技术创新中心，河北石家庄 050041；4.吉林大学动物医学学院，吉林长春 130000）

1 引言

近年来， 喹诺酮药物长期使用导致动物产生耐药性[1-3]。 马波沙星是动物专用的氟喹诺酮类抗菌药，在欧盟、新西兰等国家应用广泛，用于治疗猪乳房炎-子宫炎-无乳综合征（MMA）以及牛的呼吸道感染和由大肠杆菌引起的乳腺炎[4]。马波沙星在体内吸收迅速，分布广泛，生物利用度高，具有抗菌谱广、活性强等诸多优点，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及支原体都具有很强的抗菌活性[5]。 国内批准的马波沙星注射液可用于猪的临床疾病的治疗，仅有法国诗华进口注册的马波沙星注射液课用于靶动物牛。 本试验建立了一种高效液相色谱-串联质谱测定马波沙星的检测方法，可用于牛组织中马波沙星残留量的检测。

2 材料与方法

2.1 仪器与设备

液相色谱-串联质谱仪（岛津，LCMS-8045）；电子天平（赛多利斯，QUINTIX125D-1CN）；高速组织均质机 （安徽博进化工机械有限公司，BRS500）；台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司，H1850R）；旋涡混合器（其林贝尔，XW-80A）；旋转蒸发仪（上海亚荣，RE-52AA）。

2.2 药品与试剂

马波沙星标准物质（批号H0801511，中国兽医药品监察所）；乙腈（色谱纯，Fisher 公司）；甲醇（色谱纯，Fisher 公司）；甲酸（色谱纯，Merck）；水（GB/T 6682 规定的一级水）；其他试剂均为国产分析纯。

2.3 试液配制

2.3.1 标准储备溶液 取马波沙星标准品10毫克，精密称定，用乙腈溶解并定容于50 毫升棕色容量瓶中，置冰箱中避光保存。

2.3.2 标准中间溶液 精密量取马波沙星储备溶液5 毫升于100 毫升棕色容量瓶中， 用乙腈溶液溶解并定容至刻度，置冰箱中避光保存。

2.3.3 样品溶解液 乙腈溶液+0.1%甲酸的水溶液。

2.3.4 空白样品基质溶液 采用不含待测组分的空白样品制备。

2.4 方法

2.4.1 样品前处理

取组织样品约20 克，完全切碎后经高速均质机捣碎，用四分法缩分出适量试样，称取2 克试样（冷冻试样应解冻至室温），加乙腈-10%三氯乙酸溶液10 毫升，10000 转/分钟匀浆3 分钟， 用样品提取液5 毫升洗刀头和匀浆杯，合并样液，漩涡30 秒，4℃条件下10000 转/分离心6 分钟，上清液用10 毫升水稀释备用。

SPE 柱经甲醇3 毫升活化， 水3 毫升平衡。将备用液过柱，样液过柱速度约为1 毫升/分钟。经10%甲醇3 毫升淋洗，负压抽干，甲醇3 毫升洗脱，抽干。洗脱液于60℃氮气流吹干，用1.0 毫升乙腈-0.1%甲酸水溶液溶解残渣， 混匀，4℃条件下12000 转/分离心6 分钟， 取适量溶液经0.22 微米滤膜过滤至样品瓶中，供液相色谱-串联质谱仪测定。

2.4.2 液相色谱条件

色谱柱为C18（125×2.0 毫米，3.0 微米）；流动相：0.1%甲酸/乙腈溶液+0.1%甲酸/水溶液，梯度洗脱（梯度洗脱时间表见表1）； 流速：0.3 毫升/分；柱温：30℃；进样量：20 微升。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

2.4.3 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描； 检测方式： 多反应监测 （MRM）；DL 温度：350℃； 检测器电压：2.0 千伏； 加热器流量：600升/小时；雾化气流量：500 升/小时；干燥气流量：500 升/小时；MRM 参数（见表2）。

表2 MRM 参数列表

2.5 方法确证

2.5.1 特异性

分析不同来源空白牛组织（牛肌肉、肝脏、肾脏、脂肪）样品（n=20），观察在药峰出现的区域是否有干扰信号。

2.5.2 标准曲线

分别设置6 个不同浓度的标准工作溶液，依次为5、10、20、50、100 和200 纳克/毫升，依据设定浓度加入标准品，将所得峰面积为纵坐标，以相应的浓度为横坐标绘制基质标准曲线，得到相应的基质标准曲线方程与相关系数。

2.5.3 方法的准确度与精密度

通过添加回收试验验证方法的准确度与精密度，分别用回收率和变异系数表示准确度和精密度。 选择以10、50、100 纳克/毫升进行添加回收。每批3 个不同浓度，每个浓度5 个平行样品，重复3 批，分别计算回收率、批内变异系数和批间变异系数。

3 试验结果

3.1 特异性

在上述色谱工作条件下， 分析不同来源的空白牛肌肉、肝脏、肾脏、脂肪组织样品，目标化合物的保留时间附近没有杂质干扰，马波沙星的色谱峰保留时间为4.0 分钟左右。

3.2 重复性

选择10 纳克/毫升浓度做重复性实验，每个组织样品重复测6 次。 得到牛肌肉组织中马波沙星含量测定重复性保留时间RSD 值为1.265%，峰面积的RSD 值为2.290%；牛肝脏组织中马波沙星含量测定重复性保留时间RSD 值为0.264%，峰面积的RSD 值为0.806%；牛肾脏组织中马波沙星含量测定重复性保留时间RSD值为0.138%，峰面积的RSD 值为0.658%；牛脂肪组织中马波沙星含量测定重复性保留时间RSD 值为0.117%，峰面积的RSD 值为2.279%。均小于5%。 系统适应性良好。

3.3 测定低限

测得牛奶中马波沙星的测定低限为10.0 微克/千克。

3.4 线性范围

在10～200 纳克/毫升的浓度范围内，方法的线性关系良好，牛肌肉组织、肝脏组织、肾脏组织、 脂肪组织基质标准曲线的相关系数 （R）≥0.999，标准曲线回归方程如表3 所示。

表3 基质标准曲线回归方程及相关系数

3.5 准确度和精密度

马波沙星的添加回收率和精密度见表4 和表5。 从表4、表5 中可得出，牛肌肉组织中在10、50、100 纳克/毫升浓度的回收率在77.1%～101.4%；批内变异系数均小于2.16%，批间变异系数均小于9.77%；牛肝脏组织中在10、50、100纳克/毫升浓度的回收率在81.2%～100.3%；批内变异系数均小于2.01%， 批间变异系数均小于2.29%；牛肾脏组织中在10、50、100 纳克/毫升浓度的回收率在83.8%～97.0%；批内变异系数均小于1.41%，批间变异系数均小于3.80%；牛脂肪组织中在10、50、100 纳克/毫升浓度的回收率在80.3%～107.6%；批内变异系数均小于5.63%，批间变异系数均小于11.53%。

表4 不同批次牛肌肉、肝脏组织样品中添加马波沙星的回收率和变异系数

表5 不同批次牛肾脏、脂肪组织样品中添加马波沙星的回收率和变异系数

4 讨论

近年来，随着氟喹诺酮类药物的普遍使用，其残留检测技术已被国内外广泛研究，目前的检测方法主要包括高效液相色谱法、 液相色谱/串联质谱法、毛细管电泳法、酶联免疫法等[6]。 本实验建立了牛肌肉、肝脏、肾脏、脂肪组织中马波沙星残留液相色谱-串联质谱测定方法，方法专属性良好，空白基质中目标化合物的保留时间附近没有杂质干扰。 方法在牛肌肉、肝脏、肾脏、脂肪组织中的测定低限可设定为10.0 微克/千克；基质标准曲线范围为10～200 纳克/毫升， 相关系数＞0.998；在牛的肌肉、肝脏、肾脏及脂肪组织样品中， 马波沙星在10、50、100 纳克/毫升浓度的平均回收率在70%～120%， 批内变异系数CV≤10% ， 批间变异系数 CV ≤15%。 结果表明该方法的重复性、 灵敏度、线性范围、准确度、精密度能够满足残留检测要求。

5 结论

本研究针对新兽药马波沙星注射液应用后在牛组织中的残量检测，建立了高效液相-串联质谱法。 该方法可用于检测牛肌肉、 肝脏、肾脏及脂肪等多种组织中马波沙星药物的残留量，并且经试验研究验证，该方法的灵敏度、准确度与精密度均良好。

（支持项目： 河北省省级科技计划资助（21322601D））