微波复合酶解改性对小米淀粉结构表征及其理化特性的影响

武云娇, 王一飞, 魏明智, 季柳俊澜, 胡 鑫, 刘 伟, 魏春红, 王维浩,2, 曹龙奎,2

(黑龙江八一农垦大学食品学院1,大庆 163319)

(国家杂粮工程技术研究中心2,大庆 163319)

小米又名粟,属禾本科,因其具有良好的药用与食用价值,是我国北方重要粮食作物之一[1]。小米的主要成分为淀粉,质量分数为60%～70%[2],其次为蛋白质、脂肪、膳食纤维等。小米淀粉含有2种α-D-吡喃葡萄糖聚合物,即直链淀粉与支链淀粉[1]。直链淀粉是α-D-葡萄糖基单元通过1,4-糖苷键连接的线型聚合物,支链淀粉是由1,4-糖苷键或1,6-糖苷键连接的高支化聚合物。

在食品加工行业和材料化工领域中,淀粉因其易老化、溶解性低等缺点导致应用范围受到极大限制,因此很多学者都在努力探索新的改性修饰手法以拓宽其功能特性和生理功能。目前,对淀粉的改性方法分为物理法、化学法、酶法和复合法。其中因化学改性手段存在环境污染等问题,所以物理法、酶法、复合法已成为国内外改性淀粉的研究热点。Guo等[3]研究发现,微波具有高效节能、易于控制和强穿透性的优点,可导致多孔结构的出现,影响水合能力。Wang等[4]运用微波法处理不同晶型的淀粉,发现微波可引起淀粉间激烈碰撞,原有结晶结构被破坏,直链淀粉含量和抗性淀粉升高,形成热稳定性更好,有序度更高的结构;李若敏等[5]运用酶法制备玉米慢消化淀粉,发现酶法改性可使淀粉分支化度减少,直链淀粉含量增加,并具有良好的抗消化性。与单一的改性方式相比复合改性可使淀粉保留各改性手段的优点。白凌曦[6]运用酶法-压热法改性淀粉,发现改性后的淀粉的直链淀粉含量升高但热稳定性下降。Li等[7]利用高压-微波法改性淀粉,相比单一高压法,微波可使淀粉表面出现大量裂痕,可有助于益生菌的吸附提高其益生活性。所以,在复合改性淀粉时,微波辐射可使淀粉糊化,使分子间氢键发生断裂,形成孔隙结构[8],有利于后续脱支酶的进入,增加其作用位点,最终提高改性效率和直链淀粉含量,同时结构及理化性质也得到改善。但目前大部分的研究主要集中于淀粉单一改性手段的优化与筛选,针对于微波复合酶解改性后的淀粉结构及理化特性对比研究仍有不足。

实验以天然小米淀粉为对照,采用微波、酶解、微波复合酶解3种方法进行改性,考察3种改性手段对小米淀粉颗粒形貌、结晶、官能团等的影响,研究微波复合酶解处理小米淀粉对其结构表征和对理化性质的影响,以期为开发具有特定应用需求的改性淀粉提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

小米,市售;溴化钾(光谱级)、普鲁兰酶(1 000 ASPU/g);直链淀粉标准品、支链淀粉标准品;盐酸、无水乙醇、氢氧化钠、碘及碘化钾等化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

M1-L 213 C微波炉,TDZ 5-WS 高速离心机,Bettersize 2000激光粒度分布仪,D8 ADVANCE X射线衍射仪,Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪,NP-80系列透反射偏光显微镜,SU 8020扫描电子显微镜,Specord 210 plus紫外可见分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 小米淀粉的提取

采用干磨法[9]粉碎小米过80目筛。粉碎后的小米粉参考寇芳等[10]的方法提取小米淀粉。将提取的淀粉放入45 ℃烘箱中干燥24 h,过80目筛后得小米淀粉,记为S,提取的小米淀粉纯度为92.25%。

1.3.2 改性小米淀粉

微波改性:参考王雨生等[11]的改性方法略作修改制备MS。取淀粉4 g,加入去离子水100 mL,置于微波反应器中处理。微波时间为90 s,微波功率为700 W,在4 ℃下处理24 h,放入45 ℃烘箱中干燥24 h,过80目筛即得成品,记为MS。

酶解改性:参考Li等[12]的改性方法略作修改制备PS。取淀粉4 g,加入100 mL磷酸缓冲溶液(0.2 mol/L,pH 5.8)配成淀粉悬浮液,100 ℃水浴搅拌30 min,调节pH 5.5,加入30 U/g的普鲁兰酶,55 ℃水浴振荡16 h。加入无水乙醇灭酶,在4 ℃下处理24 h,放入45 ℃烘箱中干燥24 h,过80目筛即得成品,记为PS。

微波-酶解改性:参考Hung等[13]的改性方法略作修改制备MPS。取淀粉4 g,加入去离子水100 mL,将粉悬浮液搅拌均匀后置于微波反应器中处理。微波时间为90 s,微波功率为350 W,调pH 5.5,待冷却至55 ℃时,加入30 U/g普鲁兰酶,在55 ℃下连续振荡培养16 h,灭酶,在4 ℃下处理24 h,放入45 ℃烘箱中干燥24 h,过80目筛即得成品,记为MPS。

1.3.3 直链淀粉含量

1.3.3.1 直链淀粉标准曲线绘制[14]

分别取0.1 g支链、直链淀粉标准品各加入1 mL无水乙醇溶液,9 mL 1.0 mol/L的NaOH溶液,充分混匀,沸水浴10 min,定容至100 mL,标为支链淀粉标准液与直链淀粉标准液。分别加入0.00、0.25、0.50、1.00、1.50 mL直链淀粉标准液,支链淀粉标准液补充至5 mL。空白组用5 mL 0.09 mol/L NaOH替代混合淀粉标准液。再各容量瓶中加入1 mL 1.0 mol/L乙酸,1 mL碘液,定容至25 mL,静置10 min,在波长为620 nm下,测定吸光度。

1.3.3.2 样品直链淀粉含量测定

取0.1 g样品,加入1.0 mL无水乙醇溶液,9.0 mL浓度为1.0 mol/L的NaOH溶液,充分混匀后沸水浴10 min,取出迅速冷却至室温,定容至100 mL,得样品液。

取20 mL样品液于50 mL带塞刻度试管中,加入10 mL石油醚,摇晃10 min,静置15 min,吸去上层悬浮的石油醚层,重复此步骤3次,得脱脂样品液。

取5 mL脱脂样品液,加入1 mL浓度为1.0 mol/L的乙酸溶液,1 mL碘液,用水定容100 mL,静置显色10 min,在波长为620 nm下,测定吸光度,计算公式为:

式中:Z为样品中直链淀粉质量分数/%;A为标准曲线中所得的直链淀粉质量/g;m为样品质量/g;B为样品水质量分数/%。

1.3.4 测定颗粒微观形貌

参照薛艾莲等[15]的方法进行颗粒微观形貌测定。观察淀粉被放大1 000倍的微观结构。

1.3.5 测定偏光特性

参照刘佳男等[16]的方法测定淀粉的偏光特性。将样品混合于30%甘油中,吸取于载玻片上,去除气泡,置于偏光显微镜下观察。

1.3.6 测定晶体结构

参考陈远娇等[17]的方法运用X射线-衍射仪测定淀粉的晶体结构。测定参数为:Cu靶,电压为40 kV,电流为40 mA,扫描速率为2(°)/min,扫描范围为3°～60°(2θ),步长为0.02°。

1.3.7 测定FT-IR

取淀粉1 mg,按1∶100的比例加入KBr粉末,将两者混匀,研磨粉碎,压片,最后放入傅里叶红外光谱仪中扫描。

1.3.8 测定溶解度及膨润力

取0.4 g样品于100 mL离心管中,加入20 mL蒸馏水,混合均匀后,90 ℃水浴30 min,振荡混匀,3 000 r/min离心20 min,将上清液倒入已烘干至恒重铝盒中,在105 ℃下烘干至恒重。根据公式计算溶解度(S)和膨润力(SP)[18]:

式中:m1为上清液烘干后的质量/g;m2为离心管中沉淀物的质量/g。

1.3.9 测定透明度

参考Hu等[19]的方法并进行修改。取0.1 g样品于25 mL磨口比色管中,加入9.9 mL蒸馏水,沸水浴30 min,冷水冷却,上下颠倒数次混匀,以蒸馏水为空白对照,使用紫外分光光度计在640 nm波长下测定其透光率。每个样品重复测定3次。

1.4 数据处理

所有的实验均重复进行3次,实验数据均取平均值并计算相对标准偏差,运用Microsoft Excel 2010进行数据整理,采用SPSS Statistics 25 进行方差分析(ANOVA),以P<0.05 表示差异性显著,Origin 2019软件进行绘图处理。

2 结果与分析

2.1 改性前后小米淀粉直链淀粉含量分析

2.1.1 改性前后小米淀粉中直链淀粉含量

由图1可知,S的直链淀粉质量分数为19.21%。与S相比,改性后小米淀粉的直链淀粉含量均得到不同程度提高,其中MPS的直链淀粉质量分数提高了49.03%。Li等[12]对燕麦淀粉进行改性也得出相同结论。淀粉微波辐照时,吸收大量的热能并将其聚集在颗粒内部,伴随着膨化效应,颗粒结构变得疏松多孔[20],淀粉链间的氢键发生断裂,形成中、短链直链淀粉片段,随后普鲁兰酶的脱支作用,多孔的结构也利于增加酶作用的接触面积和接触位点,使其更容易与淀粉相结合,定向水解支链淀粉的α-1,6糖苷键,切断支链淀粉的分支点[21],最终导致直链淀粉含量明显增加。

图1 改性前后小米淀粉中直链淀粉的含量变化

2.1.2 改性前后小米淀粉微观形貌

由图2可知,S主要由2种颗粒组成,其中大部分为多边形体,少部分为圆形球体。通过观察发现多边形体的表面存在明显的凹陷,可能是小米胚乳或内源性蛋白质在淀粉提取过程中被去除所留下的痕迹[22]。MS失去原有的完整颗粒形状,呈现无规则的凝胶块,表面有裂痕且粗糙。在微波处理中,水分作为极性物质可吸收大量热能并汽化,导致淀粉颗粒剧烈膨胀直至破碎,最终形成无规则结构[7]。这与李世杰等[20]用微波处理板栗淀粉的结果一致。PS呈现碎片状,结构较致密,颗粒存在表层剥落现象,可能是因为支链淀粉被普鲁兰酶破坏脱支,分子链断裂所导致[23]。MPS的微观形貌变化最明显。淀粉颗粒体积变大,表面极粗糙且凹凸不平,出现孔隙。分析淀粉颗粒的内部与表面发生巨大破坏是微波热效应、电磁效应和普鲁兰酶酶解脱支的双重作用的结果[24]。

图2 改性前后淀粉的微观形貌图(×1 000倍)

2.1.3 改性前后小米淀粉偏光特性

天然的淀粉分子链为有秩序的排列,且球晶具有双折射特性,所以当偏振光经过淀粉颗粒时会呈现出明显的偏光十字[25]。由图3可知,S具有明显的偏光十字现象,但MS的偏光十字已经消失。经过微波处理后淀粉颗粒内部压力增大,颗粒迅速膨胀甚至破碎,分子内部的有序排列结晶结构被破坏[8],从而导致偏光十字消失,而微观形貌测定结果也表明这一点。PS的偏光十字呈现出模糊的图像。有研究指出,由于普鲁兰酶具有作用专一性和需低温酶解条件,颗粒外形相对完整,所以偏光十字不会消失[21]。但与本实验结果不同,可能是本研究先将淀粉微波充分糊化后再进行酶解导致的。MPS的偏光十字全部消失。天然淀粉经微波处理时,由于水分子的激烈振动,淀粉晶体结构被破坏,酶解后,淀粉的非结晶区被破坏,断裂出许多短直链分子,在低温过程中,部分氢键相互连接形成新的结晶结构最终导致小米淀粉的偏光十字完全消失[6]。

图3 改性前后淀粉的偏光特性图

2.1.4 改性前后小米淀粉结晶结构

天然的淀粉颗粒呈现出3种不同的晶体结构类型,即A型、B型、C型。由图4可知,S在15°、17°、18°、23°有明显特征峰,符合典型的A型晶体结构特点。同时也发现在20°的位置出现衍射峰,推测可能是直链淀粉与内源性脂质相互作用引起[26]。MS的部分特征峰强减弱,但仍具有A型晶体结构。PS与MPS的特征峰在17°、19°、22°处呈单峰,推测经过酶解和复合改性后,晶型发生转变,A型转变为B型。此结果与Ma等[27]的研究结果一致。同时Shi等[28]和Sun等[29]分别以蜡质大米和普通玉米为原料,酶解后发现淀粉晶体结构也由A型转变为B型。

图4 改性前后淀粉的X射线衍射图谱

相对结晶度是指结晶区与无定形区的相对比例。MS、PS、MPS的相对结晶度与S相比均提高,其中MPS相对结晶度升高了35.32%。有研究表明,运用微波处理白高粱[16]和玉米[30]时,微波主要破坏淀粉结晶区,其产生的热效应使淀粉的有序结晶结构遭到破坏,结晶区的双螺旋解旋,分子链趋于无序化。普鲁兰酶通过作用于支链淀粉中的α-1,6糖苷键,导致支链淀粉分支断裂,由此产生大量游离的短直链分子,支撑有序结晶结构的效果减弱,结晶区遭到破坏,但淀粉链与双螺旋结构解旋后流动性增强,利于低温过程中淀粉重结晶,晶体重组,形成新的结晶区和晶体结构[31],最终导致相对结晶度提高。该结果与闫少青[32]的结果一致。本研究淀粉的微观形貌图也显示出淀粉颗粒结构遭受严重破坏。

2.1.5 改性前后小米淀粉红外光谱图

由图5可知,在4 000～400 cm-1的范围内,S、MS、PS、MPS具有相同的红外光谱图,没有出现新的特征峰,表明改性后的小米淀粉仍具有天然淀粉的特征。在3 400 cm-1附近的强峰是由O—H伸缩振动引起,2 900 cm-1附近的峰是由CH2伸缩振动引起,1 650 cm-1附近的峰是由原料的水分子中2个O—H剪切振动引起[21],1 047 cm-1附近的峰是由C—O和C—C伸缩振动引起,1 022 cm-1附近的峰是由淀粉无定形区C—O、C—O—C振动引起[19],920 cm-1附近的峰是由α-1,4糖苷键上的C—O—C振动引起,570 cm-1附近的峰是由吡喃糖环骨架振动引起[33]。

图5 S、MS、PS、MPS的红外光谱图谱

1 047 cm-1与1 022 cm-1处的特征峰分别代表淀粉结晶区和无定形区[27]。将改性前后的样品经过傅里叶去卷积处理后,S、MS、PS、MPS的1 047/1 022 cm-1比值分别为0.951、0.907、0.871、0.936。与S相比,改性后小米淀粉1 047/1 022 cm-1的比值较低,分析可能是因为淀粉经过微波与酶解处理后,淀粉的有序结构遭到破坏,一些支链淀粉发生双螺旋解旋,淀粉分子间及分子内的氢键变化所导致本研究结晶结果相互印证[34]。

2.1.6 改性前后小米淀粉的溶解度与膨润力

溶解度与膨润力是衡量淀粉与水分子间作用力的重要指标同时也反映淀粉内部直链分子间氧键结合的紧密程度[5]。由表2可知,S的溶解度为13.51%,与S相比,MS、PS、MPS的溶解度、膨润力均出现下降趋势。分析可能因微波作用导致分子间及分子内部破坏,脱支作用导致淀粉链断裂,结晶结构改变,重结晶后形成新的致密结构,水合作用力减弱,从而导致溶解度与膨润力的改变[5]。韩雪琴等[35]指出,膨润力主要体现的是支链淀粉的性质,支链淀粉含量越高,膨润力越大[36],而直链淀粉的存在往往会抑制淀粉的膨胀发生。这与李世杰等[20]和王雨生等[11]的研究结果一致。较S相比,MPS的溶解度降至8.69%,低于MS、PS,分析可能是复合改性时,淀粉中的直链淀粉与直链淀粉间、支链淀粉间的结合力增强,与水分子的结合力下降,也有可能是复合改性中产生结构致密的分子晶体结构,与S相比稳定性更高,当膨胀发生时,会阻碍水分子进入与淀粉相结合,从而影响膨润力[36]。

2.1.7 改性前后小米淀粉的透明度

淀粉的透明度可以反映出淀粉为糊状时淀粉链的有序程度。由表1可知,与S相比,MS、PS、MPS的透明度都呈现降低的趋势。微波[31]与酶解[33]过程会导致淀粉颗粒破碎,淀粉链断裂,水分子与淀粉分子的结合作用加强,从而引起透明度上升,但与本研究结果不同,分析可能是由于改性过程中出现大量的淀粉碎片,支链淀粉大量降解的同时也产生许多短直链片段,降温过程中,低温导致大量短直链片段发生重结晶现象[5,31],聚集在一起,从而阻碍了光线的透过,导致透明度下降。该结果与蒲华寅等[37]的研究结果一致。也有学者指出,淀粉的粒径分布、直链淀粉含量以及淀粉的直/支比都会影响淀粉糊的透明度[20]。

表1 S、MS、PS、MPS的溶胀能力及透明度

3 结论

研究探讨了微波、酶解、微波复合酶解改性对小米淀粉的结构表征及其理化性质的影响。结果表明:改性后的小米淀粉颗粒破碎且表面粗糙不平,偏光十字消失,直链淀粉含量与结晶结构发生改变,红外光谱(1 047/1 022)cm-1峰强比值、溶胀力及透明度呈下降趋势。其中微波复合酶解改性对小米淀粉的影响最显著。与原淀粉相比,微波复合酶解改性后的小米淀粉颗粒结构破坏严重,直链淀粉含量与相对结晶度提高,且结晶型转变为B型。但改性手段不同也会导致淀粉的加工特性产生差异,影响其应用范围,所以可进一步探究比较微波、酶解、微波复合酶解改性小米淀粉的糊化特性和流变特性。