Ⅱ型心肾综合征大鼠模型制备方法的改良

刘茜,王新婷,程培培,戎靖枫,杨天舒,周华*

(1. 上海中医药大学附属曙光医院中西医结合心血管研究室,上海 201203;2. 上海中医药大学附属市中医医院心内科,上海 200071)

心肾综合征(cardio-renal syndrome,CRS)是指心脏和肾任意一个器官急性或慢性功能不全导致的另一器官急性或慢性损伤而引起的临床综合征,根据其病理生理特点和病程长短,可分为5 个亚型:Ⅰ型为急性心肾综合征,即急性心功能障碍(如急性失代偿性心力衰竭、急性冠脉综合征)导致的急性肾损伤;Ⅱ型为慢性心肾综合征,即慢性心功能障碍(如慢性心力衰竭、先天性心脏病)导致的慢性肾损伤;Ⅲ型为急性肾心综合征,即急性肾损伤(如急性肾小管坏死、急性肾小球疾病)导致的急性心功能障碍;Ⅳ型为慢性肾心综合征,即慢性肾病(如慢性肾小球或间质病变)导致的心功能障碍;Ⅴ型为继发性心肾综合征,即全身性疾病(如脓毒血症、糖尿病)导致的心脏、肾功能同时发生障碍[1-2]。 在心血管领域,2021 年流行病学数据显示,全球心力衰竭患者人数已达6430 万[3],约63%的慢性心力衰竭患者存在Ⅱ型CRS,明确Ⅱ型CRS 的发病机制并研发安全有效的药物迫在眉睫,急需通过高度模拟临床Ⅱ型CRS 的动物模型为发病机制研究及药物开发提供依据。 目前很多心肾综合征的动物模型构建相对笼统,并未区分以上5 个亚型,而现有的Ⅱ型CRS 动物模型构建术式繁多,手术创伤大,有些并不能很好地模拟发病和病情进展过程[4-5]。 本研究参考国内外学者的研究方法并进行改良,通过结扎冠状动脉+ 单侧肾切除术成功建立Ⅱ型CRS大鼠动物模型,为进一步的发病机制及药物开发研究奠定了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

20 只SPF 级健康的6 ~ 7 周龄SD 雄性大鼠,体重180 ~ 200 g,购于上海市计划生育科学研究所实验动物经营部【SCXK(沪)2018-0006】。 饲养环境:室温(23 ± 2)℃,湿度(50 ± 5)%,12 h 光照/12 h 黑暗,普通饲料喂养,自由获取纯净水,饲养于上海中医药大学实验动物中心【SYXK(沪)2020-0009】。 本实验开展获得了上海中医药大学实验动物伦理委员会审核批准(IACUC: PZSHUTCM 2303220006)。

1.1.2 主要试剂与仪器

异氟烷(220405,深圳市瑞沃德生命科技有限公司),庆大霉素(2207202222,辰欣药业股份有限公司),苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(C0105S,上海碧云天生物技术有限公司),改良天狼星红染色试剂盒(G1472,北京索莱宝科技有限公司),大鼠脑钠肽(BNP)酶联免疫检测试剂盒(H166-1-2,南京建成生物工程研究所有限公司),肌酐(Cr)测定试剂盒(肌氨酸氧化酶法)(C011-2-1,南京建成生物工程研究所有限公司),尿素氮(BUN)测试盒(二乙酰肟比色法)(C013-1-1,南京建成生物工程研究所有限公司),尿蛋白定量测试盒(CBB 法)(C035-2-1,南京建成生物工程研究所有限公司)。

小动物麻醉机(R540,瑞沃德),动物心电图机(VECG-2302B,广州市三锐电子科技有限公司),心脏超声仪器(Vivid,GE),石蜡包埋机(HistoCore Arcadia H, LEICA), 组织包埋冷台(HistoCore Arcadia C,LEICA),手动轮转式切片机(HistoCore BIOCUT,LEICA),石蜡切片水浴摊片机(HI1210,LEICA),组织病理学用烘片仪(HI1220,LEICA),显微数码CCD (DP71, Olympus), 全功能酶标仪(Synergy H1, BioTek), 离心机(Avanti J-15R,Beckman Coulter)。

1.2 方法

1.2.1 分组和造模

20 只SD 大鼠经适应性喂养1 周后被随机分为假手术组(n= 7)和模型组(n= 13)。 Ⅱ型CRS 造模:心肌梗死造模1 周后行单侧肾切除术,第6 周Ⅱ型CRS 成模(图1)。

图1 Ⅱ型心肾综合征造模路线图Figure 1 Model road map for type Ⅱcardio-renal syndrome

心肌梗死后慢性心衰模型的建立:在Johns 法建立心梗模型的基础上,参考文献[6-8]略作修改,采取结扎大鼠冠状动脉前降支制备慢性心衰大鼠模型。 取雄性SD 大鼠术前禁食禁水12 h,将大鼠放入诱导盒中3%异氟烷诱导麻醉,待大鼠麻醉后仰卧位固定在手术台上,使用面罩将大鼠脸部罩住,予2%异氟烷维持麻醉。 常规胸部消毒、备皮,于心尖搏动最强处稍上(第4、5 肋间)与胸骨平行处作一长约2 ~ 3 cm 的横向切口,钝性分离胸大肌,右手持钝头剪紧靠胸骨左缘插入肋间肌,沿肋骨走向扩大胸腔,暴露心脏,剪开心包膜,双手挤压胸部使心脏自行跳出胸腔外,迅速于左冠状动脉前降支起始处下方约2 mm 处用6-0 带线缝针进行永久性结扎(深度约2 mm,宽度约3 mm),结扎后确认心肌明显发白,回纳心脏至胸腔,逐层缝合胸部肌肉和皮肤,乙醇消毒术口。 以上操作均严格在无菌条件下进行。 术后立即行心电图检查,以标准导联Ⅱ(纸速25 mm/s,电压10 mm/mV)中ST 段弓背抬高为心肌梗死形成的标准。 假手术组除不结扎冠状动脉,其余操作同前。 术后腹腔注射庆大霉素预防感染。

单侧肾切除造模:心梗术后1 周,术前禁食禁水12 h。 腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠,使大鼠俯卧位固定于手术台上,右侧肋下脊直肌外侧常规消毒、备皮,在右侧肋弓下1 cm 处,脊柱向右旁开1 cm 处切开一平行于脊柱长约1.5 cm 切口,逐层切开肌肉进入腹腔,暴露右肾,分离肾包膜,暴露肾门,永久性结扎右侧肾蒂,切除右肾,注意不要伤及肾上腺。 逐层缝合背部肌肉、皮肤,乙醇消毒伤口。 假手术组除了不结扎肾蒂、不切除右肾,余操作同前。 术后腹腔注射庆大霉素预防感染。

1.2.2 超声心动图检测

两组大鼠于Ⅱ型CRS 建模完成后进行超声心动图检测,注射戊巴比妥钠麻醉大鼠,应用GE Vivid心脏超声仪器,M 型超声心动图测量大鼠左心室射血分数(left ventricular ejection fractions,LVEF)和左心室短轴缩短率 ( left ventricular fractional shortening,LVFS)。

1.2.3 样本采集及心脏、左肾重量指数测定

在大鼠取血前1 d,将大鼠放入代谢笼收集24 h尿液,并记录24 h 尿液总量。 将留取的尿液离心(常温,1500 r/min,5 min),取上清液放入-80℃保存。 留取完大鼠尿液后,称取大鼠体重,注射戊巴比妥钠麻醉大鼠,采用腹主动脉取血法收集大鼠血液标本,静置2 h 后离心(4℃,3000 r/min,15 min),取上清液放入-80℃保存。 取完血后开胸、开腹依次取出心脏、左肾,用生理盐水泡洗,滤纸吸干心脏、左肾表面水分,分别称量心脏、左肾重量。 心脏重量指数= (心脏重量/体重) × 100%。 左肾重量指数= (左肾重量/体重) × 100%。

1.2.4 心脏、肾生化指标检测

采用竞争法检测血脑钠肽(BNP),并用酶标仪分析计算吸光度。 以肌氨酸氧化酶法检测大鼠血肌酐(Scr)、尿肌酐(Ucr)。 以二乙酰肟比色法检测血尿素氮(BUN)。 以CBB 法检测24 h 尿蛋白。 计算内生肌酐清除率(creatinine clearance rate,Ccr):Ccr(mL/min) = 尿肌酐× 24 h 尿量(mL)/血肌酐× 1440。

1.2.5 组织病理学检查

取大鼠心脏、左肾组织,置于4%多聚甲醛固定、不同浓度乙醇脱水、二甲苯透明,石蜡包埋、切片。 常规脱蜡后按说明书进行HE、苦味酸-天狼星红染色,封片后采用OlympusDP71 显微数码CCD 采集图片,用Image-Pro Plus 6.1 软件进行心脏、左肾组织天狼星红阳性染色面积比(%)分析。

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析。 计量资料若符合正态分布、方差齐性,组间分析采用两独立样本t检验,并采用平均值± 标准差(±s)进行统计描述。 若不符合正态分布、方差齐性,组间分析采用两独立样本非参数检验方法Mann-Whitney U 检验,并采用中位数、四分位数间距M(P25,P75)进行统计描述。 统计检验均采用双侧检验,P< 0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 造模死亡率及心衰成功率

实验结束后,假手术组无大鼠死亡;模型组大鼠死亡3 只,剩余10 只,死亡率为23.1%(3/13),心梗造模术后24 h 内死亡2 只,考虑死亡原因为心源性休克;心梗+ 单侧肾切除术后2 周死亡1 只,考虑死亡原因为心、肾功能衰竭。 心梗术后4 周行心脏超声检测,EF > 50%则心衰造模失败,故剔除大鼠2 只,大鼠心衰成功率为80%(8/10)。

2.2 心电图检测结果

与假手术组相比,模型组大鼠心梗造模后心电图显示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVF 导联ST 段呈弓背向上型抬高,提示心肌梗死造模成功(图2)。

图2 假手术组和模型组大鼠心肌梗死造模后心电图Figure 2 Electrocardiograms of rats in the sham group and model group after myocardial infarction modeling

2.3 超声心动图检查结果

采用两独立样本t检验分析显示,与假手术组相比,模型组大鼠LVEF 明显降低(P< 0.01)。 采用Mann-Whitney U 检验分析显示,与假手术组相比,模型组大鼠LVFS 明显降低(P< 0.01)。 提示模型组大鼠心功能受损明显,心衰模型造模成功(图3)。

图3 大鼠超声心动图检查结果Note. A. Representative echocardiographic images of rats. B. Results of LVEF and LVFS in rats. Compared with the sham group, **P < 0.01. (The same in the following figures and tables)Figure 3 Results of rat echocardiography examination

2.4 心脏、左肾重量指数比较

采用两独立样本t检验分析显示,模型组大鼠的心脏重量指数较假手术组明显升高(P< 0.01)。采用Mann-Whitney U 检验分析显示,模型组大鼠的左肾重量指数较假手术组明显升高(P< 0.01)。 提示模型组大鼠的心脏、左肾体积存在代偿性增大(表1)。

表1 心脏、左肾重量指数比较(± s,M(P25,P75))Table 1 Comparison of heart weight/body weight and left kidney weight/body weight(± s,M(P25,P75))

表1 心脏、左肾重量指数比较(± s,M(P25,P75))Table 1 Comparison of heart weight/body weight and left kidney weight/body weight(± s,M(P25,P75))

?

2.5 心脏、肾生化指标检测结果

2.5.1 心脏生化指标检测结果

采用两独立样本t检验分析显示,与假手术组相比,模型组大鼠BNP 水平明显升高(P< 0.01),提示模型组大鼠心功能降低明显(表2)。

表2 心脏、肾生化指标比较(± s,M(P25,P75))Table 2 Comparison of biochemical indicators of heart and kidney(± s,M(P25,P75))

表2 心脏、肾生化指标比较(± s,M(P25,P75))Table 2 Comparison of biochemical indicators of heart and kidney(± s,M(P25,P75))

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2.5.2 肾生化指标检测结果

采用Mann-Whitney U 检验分析显示,与假手术组相比,模型组大鼠Scr、BUN 水平升高(P<0.01)。 采用两独立样本t检验分析显示,与假手术组相比,模型组大鼠24 h 尿蛋白水平升高(P<0.01),Ccr 降低(P< 0.01)。 提示模型组大鼠肾功能降低(表2)。

2.6 组织病理学改变

2.6.1 体表形态

假手术组大鼠心脏表面血管分布清晰,色泽红润,肾表面光滑有色泽。 模型组大鼠心脏呈暗红色,左心室壁梗死区明显发白,肾表面凹凸不平,可见瘀斑(图4)。

图4 大鼠心脏和肾体表形态Figure 4 Surface morphology of rats’ heart and kidney

2.6.2 HE 染色结果

假手术组的心肌细胞大小正常,心肌纤维排列整齐、分界轮廓清晰,间质内无明显炎症细胞浸润。模型组的心肌细胞排列紊乱,心肌细胞明显水肿甚至坏死,管壁外及间质中有炎症细胞浸润,结缔组织增生。 假手术组的肾小管和肾小球形态正常,无萎缩肿胀,肾小管间质无明显炎症细胞浸润。 模型组的肾小管萎缩,肾小管壁增厚伴管腔扩张,排列不规则,间质内可见炎症细胞浸润及粘液物质(图5)。

图5 大鼠心脏组织和肾组织HE 染色Figure 5 HE staining of rats’ heart tissue and kidney tissue

2.6.3 苦味酸-天狼星红染色结果

假手术组心肌胶原纤维分布均匀、排列整齐、集合成束。 模型组心肌胶原纤维明显增多,分布不均,排列紊乱,粗大的胶原纤维互相交错成网状。假手术组肾小管和肾小球结构正常,无萎缩肿胀,无纤维组织增生。 模型组可见肾间质中大量胶原纤维沉积,肾小球结构紊乱伴周围纤维化,肾小管排列不规则。 采用Mann-Whitney U 检验分析显示,模型组心脏、肾的天狼星红阳性染色面积比均较假手术组明显增加(P< 0.01)(图6)。

图6 大鼠心脏组织、肾组织苦味酸-天狼星红染色及阳性染色面积比Note. A. Picric acid Sirius red staining of rats’ heart tissue and positive staining area ratio in rats. B. Picric acid Sirius red staining of rats’ kidney tissue and positive staining area ratio in rats.Figure 6 Picric acid Sirius red staining and positive staining area ratio in rats’ heart tissue and kidney tissue

3 讨论

Ⅱ型CRS 是近年来全球关注的热点和难点问题,构建规范的、高度模拟临床Ⅱ型CRS 的动物模型可以为Ⅱ型CRS 的发病机制研究和药物开发提供依据。 Ⅱ型CRS 的造模可分为单一模型和复合模型。 单一模型造模时间长,其中给药动物模型与人体CRS 发生过程存在差异,目前最常用的是冠脉结扎联合5/6 肾切除的复合模型[9-10]。 根据文献报道,冠脉结扎多采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后先行气管插管,再开胸结扎冠状动脉,结扎完后关闭胸腔,待大鼠恢复自主呼吸后拔除气管插管完成造模[11]。 此心梗造模方法耗时长,气管插管不当可引起喉头水肿、气道损伤,增加了感染率,气管穿孔、出血、分泌物过多则易阻塞气道,引起窒息等并发症,增加造模的死亡率。 5/6 部分肾切除采用腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,切除一侧肾皮质的2/3 或结扎肾动脉的2/3 分支,1 周后再行第2 次手术,同样方法麻醉,切除另一侧肾[12-13]。 5/6 肾切除需要二次开腹,残留肾少,手术创伤大,死亡率高。 尽管上述复合模型使大鼠在短时间出现严重的心、肾功能损伤,但对于后期进行药效学研究,尤其治疗周期长的研究,心、肾功能衰竭导致的死亡率会增加,需扩大模型样本量。

根据文献报道,大鼠冠脉结扎2 周后即可出现心衰[14],4 周后心衰模型明确建立[7]。 大鼠单侧肾切除术常用于制备早期肾功能不全模型,肾切除第2 周时另一侧肾进入代偿期[15],第4 周出现肾功能损伤[16]。 冠脉结扎联合单侧肾切除术的复合模型制备Ⅱ型CRS 的研究发现,2 周内分别行冠脉结扎+ 单侧肾切除术,第6 周Ⅱ型CRS 即可成模[17-18]。因此,在确保心脏、肾功能出现障碍的前提下应选择最短成模时间,节约造模成本,缩短实验周期。

本研究参考了上述成模时间并对术式进行改良,通过小动物麻醉机下挤心脏法进行永久性结扎冠状动脉左前降支造成心肌梗死,1 周后行单侧肾(右肾)切除术,第6 周建立Ⅱ型心肾综合征大鼠动物模型。 麻醉机下挤心脏法所需麻醉时间短,无需气管插管,不存在气道损伤,减少了感染风险,降低了死亡率。 单侧肾切除减轻了造模对肾的损伤,避免了二次开腹,减少了麻药使用及感染风险。 尽管单侧肾切除不能在短时间内引起严重的肾损伤,但更符合Ⅱ型CRS 的发病特点,即慢性心功能障碍导致的慢性肾损伤[15]。

本研究改良的大鼠模型,降低了死亡率,同时,造模成功率也得验证。 心超中EF、FS 主要反映左心室的收缩功能,EF、FS 越低提示心肌收缩力越弱,心衰越严重。 BNP 主要储存于心室肌内,心衰时大量分泌,是评价心功能紊乱最敏感和特异性最高的指标之一,常用于心衰的诊断和治疗。 本研究中模型组大鼠EF、FS 较假手术组明显降低,BNP 明显升高,提示大鼠心功能损伤明显,心衰造模成功。 Scr、BUN、Ccr 和24 h 尿蛋白都是常用的反映肾功能的经典指标,当出现肾功能受损时,肾小球滤过功能下降,使得血液中Scr、BUN 排泄受到影响,造成Scr、BUN 在血液中积累。 Ccr 反映肾小球的滤过功能,判断肾小球损伤程度,滤过率越低则肾损伤越大。 肾小球损伤使滤过膜通透性增加,尿液中蛋白质含量升高,24 h 尿蛋白是反映早期肾损伤的主要指标[19]。 与假手术组相比,模型组大鼠Scr、BUN、24 h 尿蛋白水平明显升高,Ccr 明显降低,提示模型组大鼠肾功能降低。 CRS 发病机制复杂,目前较为公认的机制包括交感神经系统过度兴奋、RAAS 过度激活、炎性反应、氧化应激等,最终表现为心肌重构和肾纤维化[20-22]。 本研究通过组织学检查发现,模型组大鼠心肌细胞排列紊乱,管壁外及间质中炎症细胞浸润,结缔组织增生,心肌胶原纤维明显增多且排列紊乱。 肾小球结构紊乱伴周围纤维化,肾小管排列不规则,间质内可见炎症细胞浸润、粘液物质及胶原纤维沉积。 模型组心脏、肾的天狼星红阳性染色面积比较假手术组明显增加,提示模型组大鼠出现了心肌重构及肾纤维化。 上述实验结果证实了本模型制备方法的改良能较好地模拟Ⅱ型CRS 发病早期的心脏、肾功能损伤和病理改变。

综上所述,本研究采用在小动物麻醉机下挤心脏法进行永久性结扎冠状动脉左前降支造成心肌梗死,1 周后行单侧肾(右肾)切除术,成功建立Ⅱ型心肾综合征大鼠动物模型。 此改良模操作简便、手术创伤小、死亡率低,能很好地模拟了Ⅱ型心肾综合征早期的心脏、肾功能损伤和病理改变,为系统深入研究Ⅱ型心肾综合征的发病机制及药效作用机理奠定基础。