茯苓三萜对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用及酶动力学研究*

高满军,黄兴琼,莫启贵,陈 迷,赵宝清**,张丹丹**

(1.湖北科技学院医学部药学院,湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室)

近年来,糖尿病的发病率在全球范围内均明显上升,到2035年世界糖尿病发病率约为5.92亿人[1-2],其诱发因素与肥胖、胰岛素抵抗、嗜烟嗜酒、生活不规律等有关。由糖尿病引起的并发症诸多,涉及人体的眼、脑、心、肾、血管、神经等病变,严重危害人类健康。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是与血糖水平密切相关的两种酶,它们在控制消化和消化糖原方面起着重要作用。临床上,一类药物可以抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的功能,如阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖等,对降低餐后血糖有显著效果。但这些药物通常存在一些不良反应,如腹胀、腹泻、腹痛等。因此,寻找副作用小、安全性高的天然α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制剂势在必行。

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核,是药食两用的中药大品种,临床应用广泛,素有“十药九茯苓”之说。多糖类及三萜类是其主要药理活性成分,现代药理学研究表明,茯苓具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗心衰、保肝、免疫、镇静等作用[3-8]。现有研究表明,茯苓能够有效改善高脂饮食诱导的糖尿病大鼠胰岛素抵抗、血糖升高、胰岛素分泌不足等症状,有明显的抗糖尿病药理活性[9-12],茯苓三萜是茯苓发挥药理作用的主要成分之一。本研究考察了茯苓三萜对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制作用,为茯苓三萜类物质降血糖药物研发及其他的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

α-葡萄糖苷酶(批号:C13893463)、对硝基苯-α-D-葡萄糖苷(批号:C13575238)、谷胱甘肽(批号:EZ7890C369,含量≥98%)、α-淀粉酶(批号:C14616860)、可溶性淀粉(批号:C14493944)、磷酸氢二钾(批号:C14569133)、磷酸二氢钾(批号:C14416643)、酒石酸钾钠(批号:C14373771)、苯酚(批号:H2212440)、氢氧化钠(批号:C2201178)和亚硫酸氢钠(批号:B2218503)均购自上海麦克林生化科技有限公司。其他试剂均为分析纯,实验用水为纯化水。

1.2 仪器

UV-1900PC型紫外可见分光光度计(翱翔仪器上海有限公司),ME204E/02型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司),Milli-Q型超纯水系统(美国Millipore公司)。

1.3 不同浓度茯苓三萜的制备

茯苓三萜的制备:将准确称重的茯苓粉末样品(800.0g)在80%乙醇中回流加热两次,每次加热1h,获得茯苓醇提物,将醇提物经减压浓缩,得无醇味的浓缩液,浓缩液用乙酸乙酯萃取3次,回收乙酸乙酯层液体,将其进行减压干燥得到茯苓三萜提取物。采用香草醛-冰酸酸-高氯酸的方法,用紫外可见分光光度法测定,总三萜含量为62.26%。

α-葡萄糖苷酶抑制试验中茯苓三萜的制备:称取茯苓三萜20.00mg,精密称定,溶于500μL 95%乙醇溶液,即40.01mg/mL作为母液,吸取不同体积的母液2、8、16、32、64μL,加入PBS稀释到500μL,浓度即为1.05、4.20、8.40、16.80、33.60μg/mL。

α-淀粉酶实验中茯苓三萜的制备:分别吸取40.01mg/mL的母液1、2、3、4、6μL,加入PBS稀释到500μL,浓度即为3.20、6.40、9.60、12.80、19.20μg/mL。

1.4 茯苓三萜类物质酶动力学实验

1.4.1 不同浓度的茯苓三萜对α-葡萄糖苷酶的抑制

实验方法参照sigma公司α-葡萄糖苷酶说明书进行,固定α-葡萄糖苷酶为2U/mL,加入不同浓度(1.05、4.20、8.40、16.80、33.6μg/mL)的茯苓三萜分为5组,再将每组分为样品管、样品对照管、空白管、空白对照管,样品管和样品对照管加入0.2mL同浓度茯苓三萜,空白对照管和空白对照管加入等体积PBS,样品管和空白管中加入0.2mL酶,样品对照管和空白对照管中加入等体积PBS,混合均匀后,加入PBS 5mL、GSH 0.2mL,混合均匀,37℃水浴5min,加入0.5mL PNPG,37℃水浴20min,分别取以上各管混合溶液2mL,加入8mL Na2CO3终止反应后,立即在400nm波长下测定吸光值(A)值。每个浓度样品同时进行3个平行测定并取平均值(下同)。按公式:

釆用分光光度法测定α-葡萄糖苷酶活力,使用IBM SPSS Statistics26计算相应的IC50值。

1.4.2 不同浓度的茯苓三萜对α-淀粉酶的抑制

参照潘玥等[13]实验方法,并进行略微改动。固定α-葡萄糖苷酶为2U/mL,不同浓度(3.20、6.40、9.60、12.80、19.20μg/mL)的茯苓三萜混悬液分为5组,再将每组分为样品管、样品对照管、空白管、空白对照管,样品管和样品对照管加入200μL同浓度茯苓三萜,空白管和样品对照管加入等体积PBS;样品管和空白管中加入200μL酶,样品对照管和空白对照管中加入等体积PBS,混合均匀后加入于37℃水浴10min,再加入1%可溶性淀粉溶液200μL,混匀后于37℃水浴10min,加入800μL的DNS溶液终止反应,反应液置于沸水中加热5min后取出,于冰水浴中迅速冷却,最后用PBS补足到5mL混匀,采用紫外可见分光光度计在540nm波长处测定其吸光度,根据下列计算公式计算抑制率:

使用IBM SPSS Statistics 26计算相应的IC50值。

1.5 不同浓度的茯苓三萜物质酶抑制动力学研究

1.5.1 不同浓度的茯苓三萜物质对α-葡萄糖苷酶的抑制类型

(1)抑制可逆与否的判断。参照贺水花等[14]实验方法进行适当改动进行实验。取0.2mL不同浓度的茯苓三萜(0、1.05、4.20、8.40、16.80μg/mL),在一系列不同浓度的酶浓度下(0.5、1、2、4 U/mL),其他试剂及反应条件同1.4.1,测定其反应吸光值,在上述酶浓度下测定反应吸光值,并按照公式:

计算反应速率,然后根据酶反应速率与酶浓度之间的变化关系作图,并判断其抑制类型可逆与否。

(2)抑制竞争类型的判断。参照1.4.1的方法进行实验。固定α-葡萄糖苷酶的浓度,吸取0.2mL不同浓度(0、1.05、4.20、8.40、16.80μg/mL)的茯苓三萜溶液作为抑制剂,测定不同PNPG浓度(2、4、6、8、10mmol/L)对α-葡萄糖苷酶的酶促反应速率,以底物的浓度为倒数(1/[S])为横坐标,反应速率倒数(1/V)为纵坐标,将1/V对1/[S]进行lineweaver-Burk双倒数作图分析,观察米氏常数Km和酶促反应最大速率Vmax,确定抑制类型,即:

1.5.2 不同浓度的茯苓三萜物质对α-淀粉酶抑制类型

(1)抑制可逆与否的判断。实验参照关媛等[15]研究方法并略作修改,固定底物浓度,改变酶浓度(0.25、0.5、1、2 U/mL),反应时间30min,540 nm分光光度分别测定不同浓度的茯苓三萜溶剂(0、3.20、6.40、12.80、19.20μg/mL)反应体系的吸光值,按照1.5.1(1)的方法计算反应速率,根据酶反应速率与酶浓度之间的变化关系作图,并判断其抑制类型可逆与否。

(2)抑制竞争类型的判断。参照1.5.1(2)的方法稍作改动进行实验。选取不同浓度的茯苓三萜溶剂(1.60、3.20、6.40、12.80、19.20μg/mL)作为抑制剂,加入2U/mL的酶溶液0.2mL,混匀,分别加入0.2mL不同浓度(0.1%、0.2%、0.4%)的淀粉底物溶液,按照1.4.2的方法进行实验,540nm分光光度测吸光值。

1.6 统计学方法

采用IBM SPSS Statistics 26版及Graphpad grism 8统计软件进行数据处理与图表分析。

2 结 果

2.1 对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

由表1和图1可以看出,不同浓度的茯苓三萜物质对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。随着茯苓三萜浓度的提高,抑制效果越强,其IC50值为1.40μg/mL。

图1 茯苓三萜对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

表1 不同浓度的茯苓三萜对α-葡萄糖苷酶的抑制率

2.2 对α-淀粉酶的抑制活性

由表2和图2可以看出不同浓度的茯苓三萜物质对α-淀粉酶具有抑制作用,且随着浓度的提高,抑制效果不断增强,其IC50值为10.43μg/mL。

图2 茯苓三萜对α-淀粉酶的抑制活性

表2 不同浓度的茯苓三萜对α-淀粉酶的抑制率

2.3 不同浓度的茯苓三萜物质酶动力学研究

2.3.1 不同浓度的茯苓三萜物质对α-葡萄糖苷酶的抑制类型

(1)抑制可逆与否的判断。抑制类型可分为可逆和不可逆两类,可通过酶反应动力学进行分析。由图3可知α-葡萄糖苷酶活力的抑制动力学曲线部分重合且均基本通过原点,加入不同浓度的茯苓三萜类物质与未加抑制剂的α-葡萄糖苷酶活力的抑制动力学曲线均基本通过原点,可判断不同浓度的茯苓三萜类物质对α-葡萄糖苷酶抑制类型为可逆抑制类型。

图3 不同浓度茯苓三萜类物质对α-葡萄糖苷酶抑制动力学曲线

(2)抑制竞争类型的判断。由图4可知,随着茯苓三萜浓度的提高,其对应的双倒数曲线的横截距越小,纵截距越大,酶反应的最大反应速率(Vmax)减小,米氏常数(Km)升高,依据图线趋势所看,所有直线基本相交于x轴负半轴,可判断该动力学曲线符合线性非竞争性抑制动力学曲线的特点。茯苓三萜抑制剂与酶的非活性部位相结合,形成抑制物-酶的络合物后会进一步再与底物结合,根据此种抑制类型机理,分析可知酶与底物结合成底物酶络合物后,其中有部分再与抑制物结合,导致了酶催化反应速率的降低,减少产物葡萄糖的生成,从而可达到延缓血糖升高的目的。

图4 不同浓度茯苓三萜类物质对α-葡萄糖苷酶抑制类型曲线

2.3.2 不同浓度的茯苓三萜物质对α-淀粉酶的抑制类型

(1)抑制可逆与否的判断。以酶浓度作为横坐标,初速率为纵坐标绘制曲线,如图5所示,加入不同浓度的茯苓三萜类物质(1.60、3.20、6.40、12.80、19.20μg/mL),固定α-淀粉酶浓度为1U/mL,由图5可知,加入不同浓度的茯苓三萜物质的α-淀粉酶活力的抑制动力学曲线均趋向于通过坐标原点,且浓度的提高,斜率越小,反应初始速率越小,可判断不同浓度的茯苓三萜类物质对α-淀粉酶抑制类型为可逆抑制类型。

图5 不同浓度的茯苓三萜类物质对α-淀粉酶抑制动力学曲线

(2)抑制竞争类型的判断。由图6可知,随着抑制剂浓度增高,酶反应的最大反应速率(Vmax)减小,米氏常数(Km)升高,所有直线相交于第一象限,可判断该动力学曲线符合线性混合型抑制动力学曲线的特点。

图6 不同浓度茯苓三萜类物质对α-淀粉酶抑制类型曲线

3 讨 论

茯苓为药食两用的中药大品种,药用历史悠久,在治疗糖尿病等疾病上有显著效果,且毒副作用小,具有巨大的开发利用价值。茯苓三萜是其主要的活性成分之一,但对茯苓三萜治疗糖尿病疾病的研究很少,因此,本文较为系统地研究了不同浓度的茯苓三萜物质对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性并对其酶促反应动力学进行了分析,探究其降血糖活性。研究结果显示不同浓度的茯苓三萜类物质对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均有抑制活性,且浓度越高,抑制活性越强,三萜浓度逐渐提高后,抑制作用达到一定程度趋于平稳。酶动力学结果显示:α-葡萄糖苷酶的抑制类型为可逆非竞争抑制类型,对α-淀粉酶的抑制类型为可逆混合抑制类型。

以酶浓度为横坐标,初速率为纵坐标,当测定酶活力的体系中不存在抑制剂时,速率直线通过原点,当有不可逆抑制剂存在时,其速率直线不通过原点,不可逆抑制剂的作用相当于将原点平行向右移动;若有一定量的可逆性抑制剂时,因为抑制剂的量是恒定的,可得到一条通过原点而斜率较低的直线;以底物的浓度为倒数(1/[S])为横坐标,反应速率倒数(1/V)为纵坐标,若所有曲线(不同的抑制剂浓度)的交点在y轴上,则表明化合物为竞争性抑制剂;若在x轴上则表明化合物为非竞争性抑制剂;若交点不在坐标轴上则表明化合物为混合性抑制剂[16]。因此,根据酶动力学结果可知:茯苓三萜对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为非竞争型抑制类型,对α-淀粉酶的抑制类型为混合抑制类型。

为了进一步证明茯苓三萜物质的降血糖活性,我们后期将进行体内药理试验及作用机制的研究,研究结果可为茯苓作为α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂及其降血糖功能药品、食品的开发利用提供科学依据。