循环microRNAs作为潜在食管癌标志物诊断价值的Meta分析

张嘉诚,高 雅,孔德九,胡晓辰,柳 颖,申 深,张杰冲,原 翔,王新帅

食管癌(esophageal cancer,EC)为全球最常见恶性肿瘤之一,主要病理类型有食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)。亚洲国家主要是ESCC,而在西方国家,尤其是欧美国家中EAC占据主导地位。EC的5 a生存率只有15%～39%,绝大多数食管癌患者确诊时已处于中晚期[1]。通过对国际癌症研究机构2020年度癌症数据的统计分析表明我国是全球食管癌高发区,在中国EC发病率及死亡率近10 a来逐渐上升,而食管癌的病理进展易出现早期转移。多数食管癌患者在初期对自己的病情变化和身体异常认识不清,直至癌症晚期才被确诊,而晚期食管癌患者5 a生存率仅30%[2]。随着分子生物学技术的发展,越来越多的新方法应用于食管癌的临床检测与评估中。若能早期发现食管癌并进行诊断治疗,也许能显著提高患者生存率。因此,临床实践中急需一种适当的生物标志物用于早期筛查和诊断食管癌[3],以提高患者的总生存率。

据最近几年的调查,microRNAs(miRNA)对多种生理过程有重要作用,包括但不限于调控细胞的生长、凋亡、转移、耐药及侵袭等生理过程。目前关于食管癌相关蛋白的功能已经做了大量研究,但是其与肿瘤之间的关系还没有定论。microRNAs是一类小的RNA分子(19～22个核苷酸),通过抑制翻译或者降解靶mRNA调节基因的表达[4]。与此同时,血浆中的miRNA能较稳定地存在并表达,提示miRNA有可能作为临床生物标志物。因此,寻找新的具有特异性的分子标记物对于揭示食管癌发生发展机制以及指导个体化治疗都有着重要意义。越来越多研究资料表明,miRNA有可能成为食管癌诊断及预后的生物标志物[5]。尽管不同miRNA家族的成员在食管癌的发生发展中显示了不同生物学特征,但是对于食管癌患者来说,如何正确并精准地在早期发现也是一个重要问题。目前有研究报道,循环miRNA对多种癌症具有潜在诊断价值[6],例如消化道肿瘤、头颈部肿瘤及泌尿系肿瘤等。因此,需要有统一而明确的证据来证明这种现象是存在的。

从前人的研究资料中可以看出,由于研究设计的需要,标本类型不同,miRNA也不同,结果呈现差异性,不同miRNA组之间甚至会有互相矛盾之处。本研究做了一个系统回顾和Meta分析,并对miRNA对食管癌检测的总体诊断精度进行了评价。

1 材料和方法

1.1 检索策略所选数据库检索时间至2022年4月21日,包括中文数据库(中国知网数据库/中国万方数据库/中国维普数据库),英文数据库(embase、pubmed、Cochrane)。本研究使用了主题词和自由词的检索策略,包括以下术语:(miRNAs、microRNAs或miR)和(“食管癌”“食道癌”或“食管肿瘤”)和(“诊断”“ROC curve”“sensitivity”或“specificity”)。

1.2 研究的纳入/排除标准纳入标准:①纳入研究为自建库至2022年4月23日期间发表的诊断并使用循环miRNAs研究类型文章;②组织学亚型被指定为食管癌;③足够的数据报告生成2×2表计算真阳性(true positive,TP)、假阳性(false positive,FP)、假阴性(false negative,FN)和真阴性(true negative,TN)。排除标准:综述、摘要、质量差等不可用文献。

1.3 试验质量评估采用诊断准确性研究质量评价-2(QUADAS-2)评分系统对所选合格文章的方法学质量进行评估。独立评审,符合条件的文章由两位审稿人(王新帅和孔德九)独立审查,分歧通过协商一致意见得到解决。

1.4 数据提取必要的信息和最终合格文章中提取的数据如下:第一作者、年份、国家、中位年龄、类型(前瞻/回顾)、患癌与正常对照组、标本来源(均为体液)、方法(均为RT-qPCR)、miRNAs、表达变化和诊断Meta分析所需的数据(敏感性和特异性)。见表1。

表1 纳入荟萃分析研究的特征

1.5 统计分析数据使用Openmeta软件(开源的、跨平台的高级元分析软件)进行分析。计算综合参数的敏感性、特异性、阳性似然比(positive likelihood ratio,PLR)、阴性似然比(negative likelihood ratio,NLR)、诊断比值比(diagnostic odds ratio,DOR)及其95%CI,以评估总体诊断的准确性。同时采用双变量随机效应模型(bivariate random-effects model,BRM),并利用相关值来评价BRM的阈值效应。此外,一个χ2采用Cochran’s Q检验来评估跨研究结果的异质性。如果P<0.10和I2>50%则认为存在异质性,并根据纳入研究的特征进行Meta回归和亚组分析来分析异质性。本研究进行了敏感性分析用于评估此分析的稳健性,同时也采用漏斗图不对称性检验来评估所选研究的发表偏倚。

2 结果

2.1 检索结果经过对数据库的文献检索,共纳入667篇文章的相关研究,其中194篇文章因重复被剔除。其余473篇中有412篇因标题及摘要筛选被剔除。最终检索到满足基础条件的文章61篇,其中51篇文章因下述原因被剔除在外:①研究不是食管癌诊断研究;②缺乏足够的敏感性和特异性数据;③标记物不是miRNA;④研究为动物研究、会议摘要、预后研究、综述或其他评审在全文筛选过程中。最后,根据纳入和排除标准,10篇文章15项研究被纳入诊断Meta分析[7-16],本研究中共纳入样本量为1 846例,其中实验组1 139例,对照组707例。

2.2 研究特点和质量评价表1显示2012年至2021年发表的符合条件研究的特征。包括单miRNA检测和多miRNA面板检测,并将检测结果作为单独分组的数据进行考虑。如果一篇文章包含两个独立的测试(发现组和验证组),则将结果视为两个数据集。这10篇文章包括15项研究,包括944例食管癌患者和612例对照组。在所有纳入的研究中,食管癌都是通过病理诊断的。10篇诊断文章中包括了几个国家和地区:7篇关注亚洲,2篇关注欧洲,另外1篇文章主要关注美国。有5篇文章同时包括单miRNA检测和多miRNA面板检测。1篇文章仅使用了多重microRNA面板分析,而其余7篇文章研究了多重microRNA的诊断性能。使用RevMan5.3进行的基于QUADAS-2的质量评价结果表明所有研究均为中等高分,并纳入了相对高质量的研究。结果对10篇文章中的15个数据集进行了定量综合分析。

2.3 食管癌中循环miRNAs的诊断本实验使用Openmeta软件构建了用于检测食管癌的miRNA检测的NLR、PLR和DOR的森林图谱,而异质性分析显示,NLR的I2值为86.95%(P<0.001),PLR值为75.65%(P<0.001),DOR值为75.05%(P<0.001),结果显示存在着显著的异质性;因此为了确保结果的准确性本研究选择了随机效应模型。总体汇总结果的敏感性和特异性分别为0.838(95%CI:0.782～0.882)和0.780(95%CI:0.691～0.848),表明中等准确度。总体DOR、PLR和NLR分别为22.532(95%CI:12.237～41.487)、3.598(95%CI:2.622～4.937)和0.185(95%CI:0.121～0.283)。

2.4 亚组分析对于研究数据进行了亚组分析,以此探索检测到的miRNA的潜在诊断价值。对研究设计类型(前瞻性对比回顾性的结果表明,回顾性类型比前瞻性类型更能够准确检测miRNA)。此外,1个数据集包含多个miRNA面板,9个数据集包含单个miRNA。多miRNA 面板检测比单miRNA检测诊断更准确,DOR从22.53增加到30.428。

2.5 发表偏倚进行发表偏倚分析是为了确保本研究结果不受任何个体研究的显著影响。数据表明每项研究都有足够的价值。此外,Deeks的漏斗图不对称性检验均未检测到显著发表偏倚。上述测试证实了本研究Meta分析结果的稳健性。见图1。

图1 Deeks漏斗图评估潜在的发表偏倚

3 讨论

食管癌为世界上最常见的八大恶性肿瘤之一,在癌症相关性死亡数据统计中高居第六位[16]。男性患食管癌的人数比女性多,这种现象可能与雌激素对食管壁有一定保护作用有关[17]。食管癌的发病率在地理性上有比较明显的差异,北方地区食管癌的发病率高达100/10万,是西方一些国家发病率的20倍左右[18]。而且由于我国食管癌也有较多的癌症相关死亡病例,特别是北方地区的河南省,其死亡率一直备受医务工作者及相关研究人员的重视[19]。

在食管癌早期,尚无良好肿瘤标志物可作为临床检测指标,而肿瘤标志物CA724、CA211已有报道和研究进展,其特点为特异性强、敏感性差,而miRNA作为临床检测指标,具有重要的应用价值。与蛋白质相比,miRNA化学性质较稳定。miRNA在组织、唾液和血液中分布很广,同时可与Argonatute-2和高密度脂蛋白联合作用,也可在凋亡小体中存在,而且具有对内源性核酸酶的抗性,能够耐受酸碱环境,即便是保存了几十年的石蜡组织,也能维持在一个相当平稳的水平,并且可以采用例如qRT-PCR等高通量手段检测,重复性较好,检测结果的表达水平在各个体间均能表现出同质性[20]。这些性质使得miRNA很适合用作生物标记物。大量有关miRNA诊断价值研究问世,但由于所采用的研究设计各不相同,结果至今仍有争论。所以本研究开展了此次Meta分析,目的是为了判断miRNA检测是否可行及其整体诊断价值。

miRNA与体内许多信号通路相关,还可作用于肿瘤细胞增殖和侵袭等多种生物过程,对于影响迁移与转移是通过对信号通路上的一些基因发挥作用来实现的,最终诱发或抑制肿瘤发生[21]。在这项Meta分析中,miRNAs作为一种诊断性生物标志物,循环miRNAs在鉴别食管癌中具有中等的诊断准确性,联合DOR为30.428,合并敏感性为0.838,合并特异性为0.780。作为单一指标的优势,合并的DOR为22.532,且这些值表明有更好的测试性能。本研究还发现,似然比(PLR和NLR)对测量诊断准确性更有临床意义。在本研究的Meta分析中,发现NLR值只有0.185,这指的是经食管癌检测阴性的人除以未经食管癌检测阴性的人的概率。上述结果提示,循环miRNAs可以明显区分出食管癌患者与健康患者。2013年,Xie Z等[14]研究发现,食管癌患者唾液中可检测出miRNA-144、miRNA-21等多种miRNA,推测它们有可能是食管癌的潜在生物标志物。

近年来,Xie Z[14]经研究发现miRNA-144对肺癌,胃癌,甲状腺乳头状癌,骨肉瘤,结直肠癌等各种癌症具有抑癌功能。有研究指出miRNA-144在食管癌组织内的表达与食管癌周围的组织有较为明显的差异。食管癌组miRNA-144表达水平低于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05),表达水平与食管癌分期及有无淋巴结转移有关(P<0.05)。这和前期研究发现食管癌组织miRNA-144的表达减少结果相符。这可能与其miRNA-144有可促进细胞早期凋亡、抑制细胞侵袭及增殖等作用有关。miRNA-21和miRNA-144正好相反,它在各种癌症中均有较高的表达水平。食管癌细胞内的miRNA-21能促进食管癌细胞增殖,迁移和新生血管的形成[18]。因而能在食管癌细胞内起到癌基因的作用。Xie Z等[15]研究表明食管癌组血清外泌体起源miRNA-21的表达水平较健康对照组高,结果表明差异有统计学意义(P<0.05)且表达水平和食管癌分期及有无淋巴结转移有关(P<0.05)。在此基础上,本研究评价了miRNA-144,miRNA-21用于食管癌早期诊断的价值,结果表明:两种miRNA联合检测准确度明显优于单独检测,而其特异度亦显示较高水平。上述研究结果提示miRNA-21和miRNA-144共同检测在食管癌早期诊断中的价值比单独检测要高,二者共同检测能更加精确地区分食管癌人群与健康人,继而提高食管癌的早期发现率。

综上所述,根据Meta分析,对于诊断早期食管癌而言,循环miRNA可能是一种新的、无创的检测生物标志物,特别是多个miRNA面板,有可能在临床实践中作为筛查工具同时具有潜在的诊断价值。有研究表明,许多miRNAs在Barrett食管患者中的表达与正常食管上皮组织中的表达存在着显著差异[21-22]。本研究结论仅只是由少数几个样本获得的,还需要扩大样本深入研究。虽有上述局限性,但本研究通过Meta分析发现,循环miRNA有可能作为非侵入性的生物标志物用于早期食管癌检测和诊断,尤其是几种miRNA面板的组合,可能是一种能够在临床上用于早期食管癌发现的筛查工具,可能存在极其重要诊断价值。这些结论还有待于进一步的大规模前瞻性研究,以期在提高准确性同时探索最为高效的miRNA组合方式。