毛果杨RAV 基因家族生物信息学与组织表达分析

范文欣 刘秋艳 陈 甜 王一淇 王海凌 王晓立

（宿迁学院建筑工程学院园林教研室，江苏 宿迁 223800）

毛果杨（Populus trichocarpa）为杨柳科半常绿乔木，具有易繁殖、生长迅速等特点，是木本植物研究的模式生物。转录因子是一类能够与DNA 序列特异性结合[1]，调节基因转录本表达的蛋白质。转录因子在植物的生长发育、代谢反应和抗逆反应等多种过程中发挥重要作用[2]。RAV 属于AP2/ERF转录因子家族的一个亚家族，仅在植物中存在，对植物的多个生物学过程有重要意义。RAV 蛋白同时含有B3 保守域和AP2 保守域[3]，其中B3 保守域能特异地与靶序列CACCTG 结合，处于蛋白C 端；处于蛋白N 端的AP2 结构域则与GCC 盒结合密切相关。相关学者已在多个植物中对RAV 家族进行了全基因组分析：荔枝[4]（Litchi chinensis）和杧果[5]（Mangifera indica）中鉴定得到4 个RAV 转录因子；新疆沙冬青[6]（Ammopiptanthus mongolicus）、钻天柳[7]（Chosenia arbutifolia）、二倍体棉花[8]（Gossypium australe）和龙眼[9]（Dimocarpus longan）中的RAV 成员数量分别是2、4、10和4个；在拟南芥中[10]鉴定有13个RAV基因，其中有6个具有AP2结构域，其他则只具有B3 结构域。可见不同物种之间RAV 基因家族数量和具有AP2结构域的基因数量有一定的变化。

RAV 转录因子不仅参与植物一系列的生长发育过程，还参与植物对外界的胁迫反应，同时还在抗病性中发挥重要作用。RAV 同源蛋白在植物中是一个庞大的蛋白家族，其调节生物学功能的分子机制和功能多样性还需进一步研究和证明。RAV 同源蛋白在毛果杨植物中研究尚不多见。目前，有关毛果杨RAV 家族的相关报道较少。本研究对毛果杨RAV 同源蛋白进行鉴定，分析蛋白结构特征，为RAV 同源蛋白功能的解析、植物的生长发育及抗逆研究提供理论基础，同时也为后期分子辅助育种和生物技术工具提供依据，从而培育出达到经济目的的优良品种。

1 材料与方法

1.1 数据获取

通过Phytozome数据库（https∶//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）检索“RAV”，查找并获得毛果杨RAV基因序列。

1.2 分析方法

1.2.1 RAV 蛋白基因的搜索与确认RAV蛋白的同源序列在毛果杨基因组中作为候选蛋白，然后对所有候选基因的候选蛋白结构域进行在线分析预测位点上的PFAM 和SMART 蛋白结构域分析。得到的基因是毛果杨的RAV 基因家族的全部成员。

1.2.2 毛果杨RAV 基因家族结构分析毛果杨基因家族成员结构分析：基因名称，基因序列大小，编码序列大小等信息。

1.2.3 毛果杨RAV 基因家族理化性质分析和亚细胞定位利用Expasy 的ProtParam 软件（HTTPS：/Web.Expasy.org/ProtParam/)分析RAV 基因家族成员的物理和化学特性。毛果杨RAV 基因家族成员的亚细胞定位是通过在线软件Plant-MPloc 进行预测的。

1.2.4 motif 结构对比和系统发育树构建通过MEME Suite 5.5.1（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）进行基序结构分析，使用MEGA 7.0软件为毛果杨、甜橙、番茄、拟南芥和黄瓜等的RAV基因家族成员构建系统发育树。

1.2.5 毛果杨RAV 基因家族器官组织的基因表达在Affymetrix 网站上搜索RAV 基因家族成员的探针，并通过BAR 数据库（bar.Utoronto）检索成员的组织表达的相对量。运用聚类热图软件Multiple Experiment Viewer 绘制RAV 基因家族组织表达热图。

2 结果与分析

2.1 毛果杨RAV家族的鉴定

在Phytozome中以“RAV”为关键词进行检索，选取6个毛果杨基因序列，6个基因的蛋白氨基酸数长度在369～2 556，Potri.002G173300.1 蛋白质氨基酸数比较大，在2556。在Expasy（Expasy ProtParam tool）数据库中可以看出，Potri.002G173300.1 蛋白质为酸性蛋白，理论等电点为6.2；其余成员均为碱性蛋白（理论等电点均大于7）。6 个基因的蛋白相对分子量在42 725.38～281 004.09，Da，Potri.002G1733 00.1 蛋白质相对分子量最大。6 个基因的蛋白不稳定系数在42.76～78.05。毛果杨RAV 基因平均亲水系数在-0.378 与-0.723，Potri.002G173300.1 蛋白质亲水系数较大在-0.073，均为亲水性蛋白。毛果杨RAV 基因编码的蛋白质主要定位于细胞核和细胞质中，只有Potri.002G173300.1的蛋白质定位预测在叶绿体或细胞核中出现。毛果杨RAV 基因家族的理化性质和亚细胞定位如表1所示。

表1 毛果杨RAV基因家族的理化性质和亚细胞定位

2.2 毛果杨RAV氨基酸序列比对在线分析

利用MEGA5软件，对6个毛果杨的氨基酸序列进行在线分析（图1）。标星号序列标注的同源性更高，呈现高度保守的特征。

图1 毛果杨RAV基因家族氨基酸序列比对

2.3 毛果杨RAV系统发育树分析

为更好地了解毛果杨RAV基因家族的系统发育关系，将毛果杨（6个），甜橙（orange1.1 g 046898m、orange1.1g018549m、orange1.1g017035m），番茄（Solyc05 g 009790.1、Solyc03g083110.1、Solyc04g007000.2），拟南芥（AT1G50680、AT1G51120、AT1G25560），黄瓜（Cucsa.142990、Cucsa.147340）RAV基因编码的蛋白质序列通过MEGA7 软件进行蛋白质氨基酸序列分析，并构建6 个毛果杨与其他物种植物RAV 蛋白系统进化树（图2），将RAV 基因家族分成4 个相对独立的亚族。亚族III 仅含一个番茄成员Solcy03g083110.1；亚族IV 仅含一个毛果杨成员Potri.002G173300；这两个亚族可能是在番茄、毛果杨中独自进化的结果，也可能是其他相关物种中发生了基因丢失现象。亚族I中基因数目最多，含8个基因，来自毛果杨、甜橙、拟南芥和黄瓜4 个物种，Potri.006G186301.1 与Potri.018G109201.1 在同一分支点上，与Potri.003G212800.1有一定差异性；亚族II中包含7个基因，由来自毛果杨、甜橙、番茄、拟南芥和黄瓜5 个物种的RAV 成员构成，Potri.010G12920 0.1与Potri.008G117100.1在同一分支点上。

图2 RAV基因家族系统发育树

2.4 毛果杨RAV motif分析

选用6 个毛果杨RAV 基因家族成员，发现毛果杨RAV 基因的序列长度差异不大。从毛果杨RAV家族蛋白motif 分析可以看出（图3），Potri.002G173300 基因较其他RAV 家族蛋白的氨基酸数量差距都比较大，且只有1个相同的蛋白质基序，这也同RAV基因家族系统发育树中Potri. 002G173300基因单独被列为一支一致。其余RAV 基因家族蛋白与拟南芥AT1G25560、AT1G50680 具有类似的motif 结构，总体上看PtRAV 具有比较保守的基因序列。

2.5 毛果杨RAV基因家族表达分析

选用5个毛果杨RAV基因家族成员（Potri.003G 212800.1未查询到相应探针），通过BAR数据库检索RAV基因家族成员组织表达的相对量（图4）。所选用的5个不同的毛果杨RAV基因家族成员在发育过程中的表达存在明显的差异，其在根、茎、幼叶、成熟叶、雄蕊、雌蕊和顶芽中均有表达，毛果杨RAV基因在顶芽中整体表达量较高，Potri.008G117100最高达132.18，在根、茎与幼叶中基因表达量次之，在雄蕊和成熟叶中基因表达量较少，雌蕊中基因表达量最低，Potri.006G186301 基因在雌蕊中不表达，这说明该基因同源蛋白为不稳定蛋白。除此之外，在5 个家族成员序列中，Potri.008G117100和Potri.010G129 200基因表达相近，Potri.002G173300和Potri.008G11 7100、Potri.010G129200 基因表达有一定差异性，Potri.018G109201 差异性最大，Potri.018G109201 主要在叶片中表达量最高。因此，可推测，毛果杨RAV 家族蛋白不仅具有多样性，与亲缘关系较近的蛋白还具有相似或相近的基因表达。

图4 毛果杨RAV基因家族组织表达

3 结论与讨论

RAV 是AP2/ERF 转录因子亚家族成员，在生物与非生物胁迫中发挥重要作用，但对其在杨树中的功能探讨较为有限[11]。RAV基因不仅参与植物的一系列生长发育过程，并且还参与植物对外界的胁迫反应，在抗病方面也发挥着重要作用。RAV 家族是AP2/ERF 转录因子家族中一个重要的亚家族，仅存在于植物中，对植物的多个生物学过程都具有重要意义[12]。RAV转录因子不仅参与植物一系列的生长发育过程，还参与植物对外界的胁迫反应，同时还在抗病性中发挥重要作用。水稻OsRAV11 和Os-RAV12 可能对水稻种子的大小和心皮分化过程起调控作用[13]。Cao 等[6]在烟草上的研究发现，NtRAV-4 被沉默后，种子萌芽和根系发育的速度变快，且叶片光合能力增强；下调NtRAV-4 后烟草植株的抗旱性增强。

经分析，毛果杨中一共获得6 个PtRAV 基因。PtRAV 蛋白序列长度和分子质量相对稳定，而等电点等性质差异较大，这与相关学者对烟草的研究结果相似[14]。亚细胞定位分析发现，PtRAV 均定位于细胞核与细胞质中，这与其他植物中如杧果和苦荞等的结果相似[6,15]，推测PtRAV主要在细胞核与细胞质中发挥作用。通过对拟南芥、番茄、甜橙等RAV蛋白进行系统进化、保守结构域和保守基序分析发现，LcRAV聚集在第I、II和IV 3个亚族。同一亚族蛋白的保守结构域的位置、保守基序的种类和位置趋向一致，并且不同植物RAV之间至少存在5个共同的保守基序，分别是motif 1、motif 3和motif 2（5′→3′），同时motif 1 和motif 2/3 可能分别是AP2 结构域和B3结构域的主要组成部分，这与Ji 等[16]的研究结果一致，也说明了RAV家族具有较高的保守性。毛果杨RAV 家族蛋白不仅具有多样性，对于亲缘关系较近的蛋白，它们还具有相似或相近的生物学功能和理化性质。

本研究基于毛果杨全基因组分析，鉴定出6 个RAV基因家族成员，系统分析了毛果杨RAV同源蛋白的基本结构信息、进化关系、理化性质、亚细胞定位和组织表达分析等信息，为克隆毛果杨RAV同源蛋白提供信息，并为RAV 同源蛋白功能的解析、调控网络的构建以及为植物的生长发育及抗逆中的作用研究提供一定的参考。对于亚细胞定位等相关预测结果仍需要试验验证，涉及的代谢通路等将是后续研究的主要内容。