低频脉冲电磁场联合中药对膝骨关节炎小鼠MMP-13和Col-X的影响

李心芸,熊振飞,吴杏英,汤样华

(1.杭州市萧山区第一人民医院 康复科,浙江 杭州311200;2.杭州市萧山区中医院 骨科,浙江 杭州311201;3.浙江中医药大学 第三临床医学院,浙江 杭州 310053)

关节软骨纤维化、退行性变和丢失,关节边缘和软骨下骨骨质再生,以至关节不稳、半脱位和屈曲性挛缩是膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)的主要发病机制[1],与正常磨损、年龄及肥胖等密切相关[2]。KOA的总发病率达到8.1%,其中,在60岁以上人群中高达30%[3]。目前临床治疗KOA尚无特效药,多用非甾体抗炎镇痛药、膝关节镜治疗及人工膝关节置换等,但常伴有各种副反应及并发症[4]。

低频脉冲电磁场作为一种无创伤、费用低廉、可长期使用的非药物疗法,近年来成为骨关节炎物理治疗领域的研究热点。中医辨证分型分期研究发现[5],骨关节炎以肝肾亏虚、气血不足为本,局部血瘀为标。团队前期研究结果[6-7]显示,自拟益气化瘀补肾方对气虚血瘀型膝骨性关节炎具有较好的治疗效果。本研究选取基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、X型胶原蛋白(Col-X)作为观察指标,从分子生物学、形态学角度来探讨益气补肾化瘀方联合低频脉冲电磁场对小鼠膝关节软骨组织的影响。

1 实验材料和方法

1.1 实验动物 SPF级雄性C57BL/6小鼠45只(8周龄)由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供(动物生产许可证号SCXK(沪)2013-0016)。饲养条件:(22±2) ℃ 恒温,湿度50%～60%,光照每12 h明暗交替,换风次数15～20次/h。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。本研究通过杭州市萧山区第一人民医院医学伦理委员会审核。

1.2 主要试剂和仪器 本研究中所用主要试剂包括Trizol、RIPA裂解液、PMSF、Citrate 柠檬酸盐缓冲液(MDL)、苏木素染液、DAB kit、MMP13 抗体、beta Catenin Antibody、小鼠TNF-α ELISA试剂盒、番红固绿染色试剂盒、小鼠IL-1β ELISA试剂盒、SYBR Green qPCR试剂盒、HiFi-Script cDNA第一链合成试剂盒等,主要仪器有低频脉冲电磁场治疗仪(龙之杰,型号LGT-20000A)、Micro-CT(ZKKS,型号MCT-Ⅲ)、酶标仪(MD,型号CMaxPlus)、核酸定量仪(Thermo Scientific,型号Nanodrop one)、实时荧光定量PCR仪(罗氏,型号LightCycler© 96)、正置荧光显微镜(Leica,型号DM3000)、成像系统(日本尼康,型号Nikon DS-U3)。

1.3 动物造模 小鼠适应性饲养1周后选取 42只小鼠制作膝骨关节炎模型。剩余2只小鼠作为阴性对照组,1只小鼠备用。模型组小鼠禁食24 h后用0.3%戊巴比妥钠(100 μL/10 g)将小鼠深度麻醉并固定在恒温手术板上,右侧膝关节备皮、碘伏消毒,将模型组小鼠膝关节内侧切开,暴露髌韧带,钝性分离韧带与右侧肌肉间的筋膜,并向上分离股四头肌,直至将镊子插入到髌韧带下方后,牵拉韧带能将髌骨及韧带拉向膝关节外侧为止。将髌韧带引向膝关节外侧,暴露膝关节腔,弯屈膝关节,暴露前交叉韧带,在直视下,将其剪断或割断,行前抽屉实验以验证前交叉韧带已剪断。清洗伤口,逐层缝合,术后每天肌肉注射给予小鼠青霉素5 000 U,连续3天。对照组小鼠钝性分离肌肉和筋膜,同样牵拉髌骨至一侧,但不剪断前交叉韧带。

造模8周后,分别取2只造模组小鼠、2只阴性对照组小鼠眼眶血清,离心后取上清液,检测并对比2组血清中IL-1β和TNF-α的含量,结合胫骨平台软骨组织形态及后期Micro-CT表现,确定小鼠造模是否成功。

1.4 分组及处理 于单腿造模2个月后选取2只小鼠验证是否造模成功,其余40只按随机数字表法分为空白对照组、中药组、低频脉冲电磁场组、联合组,每组各10只。空白对照组和中药组分别予以生理盐水、益气补肾化瘀方水煎剂灌胃,每次1 mL,每日2次;低频脉冲电磁场组予低频脉冲电磁场治疗,每天1次,每次30 min;联合组在中药灌胃的基础上加用低频脉冲电磁场。益气补肾化瘀方:黄芪15 g、党参12 g、川芎12 g、丹参9 g、仙灵脾12 g、补骨脂12 g、防己10 g、牛膝12 g,每次制成水煎剂200 mL。膝关节电磁场治疗的具体参数根据临床应用参数结合查阅文献[8-9]制定:①磁场强度采用两档强度交变,第一档强度为2.5～3.5 mT,第二档强度为 3.5～4.2 mT;②频率共8档,按出现顺序依次为32、28、24、22、20、16、12、8 Hz,治疗过程中采用频率扫描模式,每4 min变化1档。所有组均连续处理2个月。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 小鼠膝关节CT影像表现 干预结束后,先行Micro-CT扫描各组小鼠右膝关节:参数为电压45 KeV、电流555 μA、功率25 W、曝光时间48 ms、分辨率35 μm、扫描角度180°,做9 μm连续扫描后选取一个固定的兴趣区(ROI)体积进行数据分析。运用NRecon软件和CTvox软件进行小鼠脚掌的三维图像重建和绘制3D立体图,记录骨体积分数(BV/TV)、骨小梁的厚度(Tb.SP)、分离度(Tb.SP)和选取 ROI 体积(TV)。

1.5.2 KOA小鼠膝关节组织Col-X、MMP-13 mRNA表达 颈椎错位法处死各组KOA小鼠,提取组织样本以备用:迅速剃掉小鼠腿部肌肉及韧带,暴露小鼠右膝关节,清除膝关节周围的软组织及韧带等,将右膝关节上下约1 cm截断。Trizol提取各组模型小鼠的细胞总RNA,并用mRNA反转录试剂盒,反转录成cDNA。取反转录产物进行实时荧光定量PCR。qRT-PCR反应条件为:94 ℃,40 s; 56 ℃,40 s,72 ℃,1 min,共40次循环。qRt-PCR引物序列见表1。

表1 小鼠qRT-PCR引物序列Table 1 Mice qRT-PCR primer sequence

1.5.3 膝关节软骨组织形态及MMP-13表达 取关节软骨固定、石蜡包埋,采用番红-固绿染色、免疫组化染色分别观察膝关节软骨组织形态及MMP-13表达情况。

2 结果

2.1 造模情况 整个实验过程中,没有发生动物死亡和感染现象。造模8周后,造模组血清IL-1β和TNF-α水平高于阴性对照组,差异有统计学意义(均P<0.001),见图1。获取小鼠膝关节组织样本时发现造模后的小鼠胫骨平台软骨逐渐出现色泽改变、局灶充血、表面磨损、软骨表面龟裂、溃疡形成,后期Micro-CT检测时发现造模小鼠膝关节骨体积分数与骨小梁厚度较正常值低。结合相关文献[10],提示骨性关节炎小鼠造模成功。

注:与空白对照组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01。图1 模型组与空白对照组小鼠血清中的 IL-1β﹑TNF-α水平比较Figure 1 Comparison of serum levels of IL-1β and TNF-α between the model group and the control group

2.2 膝关节组织Col-X与MMP-13 mRNA表达 与空白对照组相比,中药组、低频脉冲电磁场组、联合组KOA小鼠膝关节组织中Col-X与MMP-13的表达水平均降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。其中,联合组最低。见表2。

表2 KOA小鼠膝关节组织中Col-X、MMP-13 mRNA的表达水平Table 2 Expression levels of Col-X and MMP-13 mRNA in knee tissue of KOA

2.3 膝关节软骨组织的变化情况 番红-固绿染色显示:空白对照组膝关节表面有较大裂隙,软骨缺失,软骨基质番红染色不明显,软骨细胞数量严重减少,潮线模糊不清;与空白对照组相比,低频脉冲电磁场组、中药组、联合组骨平面较为完整,磨损程度较轻;尤其是联合组,骨面基本完整无明显磨损。见封三图1。

2.4 小鼠膝关节软骨组织中MMP-13的表达情况 免疫组化检测显示:中药组、低频脉冲电磁场组、联合组小鼠膝关节软骨组织中的MMP-13蛋白表达量均低于空白对照组,且联合组低于其他2个治疗组,差异均有统计学意义(P<0.01)。见封三图2。

2.5 小鼠膝关节组织的Micro-CT表现 与中药组相比,联合组小鼠膝关节骨体积分数与骨小梁厚度均上升,差异具有统计学意义(P<0.01);2组间的骨小梁分离度与骨体积,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图2。

表3 低频脉冲电磁场对OA小鼠膝关节组织的影响Table 3 Effects of low-frequency pulsed electromagnetic field on knee tissue of OA

图2 中药组(A)和联合组(B)膝关节组织的微CT扫描影像表现Figure 6 MicroCT scanning image of knee tissue in the Chinese medicine group (A) and the combined group (B)

3 讨论

中医学治病求本,标本皆治,且副反应较少,日渐成为临床治疗KOA的研究热点之一。本研究团队前期研究结果[6-7]表明:骨关节炎以肝肾亏虚、气血不足为本,局部血瘀为标;自拟益气化瘀补肾方对膝骨性关节炎具有较好的治疗效果,基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、X型胶原蛋白(Col-X)与膝骨关节炎的发病机制及患者病程紧密相关。

低频脉冲电磁场作为一种非药物疗法,具有无创伤、 无感染、操作简单、费用低廉、可长期使用、安全性好等优势。目前,脉冲电磁场(PEMFs)正被应用于骨科康复领域以促进成骨修复和保护关节[8]。脉冲电磁场刺激骨愈合的科学基础是运用电活动给各种骨细胞施加机械负荷从而促进骨细胞的再生和修复[9]。本研究结果显示:①从分子生物学角度分析,与空白对照组相比较,低频脉冲电磁场组KOA小鼠膝关节组织中Col-X与MMP-13的表达水平有所降低,尤其是联合组KOA小鼠膝关节组织中Col-X与MMP-13的表达水平是最低的;②从解剖学、影像学角度分析,联合组KOA小鼠膝关节软骨组织损伤程度最轻,软骨及骨面基本完整无明显磨损,骨体积分数与骨小梁厚度在各组数据中最高。

MMP-13是一种能调解细胞外基质退化的关键酶。已有研究揭示MMP-13可通过各种ECM分子降解细胞外基质中90%的Ⅱ型胶原蛋白(Col-Ⅱ),而Col-Ⅱ在软骨的生理周转中发挥作用[10]。 Zhang等[11]在研究miR-320靶向抑制β-catenin并降低MMP-13表达以抑制软骨细胞胶原降解中也发现MMP-13极有可能是Wnt/β-catenin通路下游产物,这与本研究的前期研究结果相符[6-7]。一项有关动物模型类风湿性关节炎的研究[12]表明,接受抗IL-17治疗的老鼠出现MMP-13表达的减少和炎症的缓解,这支持了MMP-13在关节炎进展中的作用。当MMP-13水平升高时,软骨细胞的外层结构可能因软骨的细胞外基质退化而受损[13],从而触发KOA。本研究结果表明MMP-13水平下降最显著的KOA小鼠,膝关节软骨组织损伤程度最轻,关节退化程度也较轻,这进一步证明了MMP-13在KOA发生过程中起着关键作用。

目前,针对Col-X的研究虽然较少,但现有的研究[14]已发现,KOA软骨损伤的病理变化为软骨细胞发生肥大变性,并伴有Col-X表达增多。且He 等[15]研究发现Col-X参与了肥大软骨细胞生成的某个过程,可作为肥大软骨细胞的特异性表达标志物。Nicol等[16]在研究儿童骨生成的过程中发现Col-X在软骨细胞胚胎期和机体生长发育过程中促进软骨内成骨和使软骨细胞周围基质钙化,促进骨骼的形成和发育。同时也有相关研究[17-18]表明,胶原蛋白可通过Wnt/β-catenin通路减少软骨肥大细胞生成。本研究结果表明Col-X的下降越显著,其关节软骨损伤情况也越轻微,这也验证了上述研究结果。同时,我们也发现Col-X常与MMP-13的表达存在一定的一致性。

综上,低频脉冲电磁场能改善KOA,并在此基础上提高益气补肾化瘀方对KOA的治疗效应,加快KOA的症状改善,为KOA的临床中西医治疗方案提供了一定的科学依据和借鉴意义。低频脉冲电磁场(FPEMFs)治疗膝骨性关节炎可能有以下3个作用机制:提高软骨细胞功能减缓软骨细胞退变,保护软骨细胞;调控各种信号通路,从而引起一系列化学变化,保护软骨细胞;促进软骨蛋白的合成进而促进细胞的修复,尤其是金属蛋白酶。本研究中我们还发现MMP-13和Col-X可能存在相关性,两者常处于共同升高或降低状态,所以Col-X极有可能也参与MMP-13降解软骨细胞外基质这一过程,Cao等[19]的研究结果也进一步佐证了这一推测。前期研究发现MMP-13、Col-X与Wnt/β-catenin信号通路有着密切的关系,结合本研究结果,我们考虑益气补肾化瘀方联合低频脉冲电磁场治疗膝骨性关节炎极有可能是通过调控Wnt/β-catenin信号通路完成,这也将成为后续研究的重点方向。