正交试验设计优选黔产铁苋菜水煎法的提取工艺

魏学军，李雪营，林先燕

(黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558013)

铁苋菜作为常用中药材被《中国药典》(2020版)收录，其功能以清热利湿、收敛止血为主，主要含鞣质、黄酮类、生物碱类等成分，临床用途广泛。在贵州苗族聚集区，因其内服治疗喘咳、腹泻、红白痢疾，外用止血的疗效显著，被《中华本草》(苗药卷)收载，苗药名为“海蚌含珠”[1]。现有研究表明[2-4]，铁苋菜中所含鞣质的水解产物没食子酸具有止泻、平喘、抗菌消炎和止血的生物活性，这进一步验证了该民族地区将其水煎服治疗喘咳、腹泻、红白痢疾等症状的科学合理性。为保证其汤剂制备的应用疗效和质量，本文以没食子酸得率为评价指标，对黔产铁苋菜水煎法的提取工艺进行优选，以期为实际应用提供科学的实验性理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 Agilent 1260 Infinity II型液相色谱系统(北京安捷伦公司)；数显恒温水浴锅(上海硕光公司)；低速离心机(德国HERAEUS)；真空干燥箱(上海金山公司)；电子天平(瑞士METTLER)。没食子酸对照品(购自中国食品药品检定研究院，批号110831-201906)，乙腈为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)，水为自制重蒸馏水，其他试剂均为AR级。铁苋菜原药材(样品编号202007)采自黔南民族医学高等专科学校原云宫校区植物园试验田地，经本校中药教研室李香教授鉴定为大戟科植物AcalyphaaustralisL.的干燥全草。

1.2 方法

1.2.1 生品的制备[5]将净制后的新鲜铁苋菜摘取全叶，切成宽丝；根、茎切段，干燥后混匀即得。

1.2.2 供试品溶液的制备 称取干燥至恒重过3号筛的铁苋菜生品粉末1 g，按相关工艺提取，合并提取液，经过滤、离心后定容至100 ml容量瓶中，冷藏备用。

1.2.3 没食子酸含量测定的色谱条件 色谱柱选择Diamonsil C18(5 μm，250 mm × 4.6 mm)，以乙腈-0.05%磷酸溶液(4∶96)为流动相，检测波长270 nm，室温，流速控制为1 ml.min-1，进样量取10 μl。没食子酸对照品和供试品色谱见图1。

图1 没食子酸对照品(A)和供试品(B)HPLC色谱图

1.2.4 对照品溶液的制备 精密称取对照品22.01 mg，用流动相定容至100 ml量瓶中，摇匀即得对照品贮备液；另取1 ml贮备液用流动相定容至10 ml量瓶中，摇匀即得对照品溶液。

1.2.5 标准曲线的制备 精密移取不同体积分数对照品溶液按“1.2.3”项下色谱条件进行测定，以对照品溶液浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标制作标准曲线，得回归方程：A=3.522 3×107C-1 025.493 5(r=0.999 9)。对照品在0.022 0～0.220 1 μg范围线性关系良好。

1.2.6 方法学考察 取对照品溶液10 μl，连续进样6次，按“1.2.3”项下色谱条件测定，峰面积RSD值2.13%，说明仪器精密度高。另取对照品溶液10 μl，按“1.2.3”项下色谱条件分别在 0、30、60、120、180、240 min测定，峰面积RSD值2.61%，说明对照品溶液在240 min内稳定。另称取干燥至恒重过3号筛的铁苋菜生品粉末1 g，5份，按实验号1条件制备供试品溶液，微孔滤膜过滤，按“1.2.3”项下色谱条件测定，峰面积RSD值2.07%，说明该方法重现性好。取已知含没食子酸量的铁苋菜生品粉末1 g，5份，按实验号1条件制备供试品溶液，微孔滤膜过滤，按“1.2.3”项下色谱条件测定，对照品平均回收率98.82%，RSD值 1.79%。

1.2.7 含量测定 精密移取不同实验号样品提取所得供试品溶液，微孔滤膜过滤，按“1.2.3”项下色谱条件测定并计算没食子酸得率。

1.2.8 因素水平 根据单因素预试验考察结果，固定提取2次，另选取固液比(A)、提取温度 (B)、提取时间 (C)作为考察因素，各因素取3个水平。详见表1。

表1 因素水平表

1.2.9 工艺优选 按实验号称取9份样品，每份1 g，依据正交试验安排表进行提取并测定没食子酸得率(表2)。数据采用SPSS 23.0软件包分析处理，以直观分析结合方差分析(表3)确定最优工艺参数。

表2 正交试验安排表及结果

表3 方差分析结果

2 结果

2.1 提取工艺 从表2的R值和K值作直观分析，可选择工艺参数为A3B3C3。表3方差分析结果表明，提取温度(B)对没食子酸得率影响显著(P<0.05 )，故确定B3；提取时间(C)和固液比(A)对得率的影响无显著性(P>0.05 )，从节约溶媒和时间的角度考虑，提取时间确定C1、固液比确定A1，得优选的最佳提取工艺参数为A1B3C1。

2.2 验证试验 称取干燥至恒重过3号筛的铁苋菜生品粉末5份，每份1 g，按优选的最佳提取工艺参数制备供试品溶液，微孔滤膜过滤后按“1.2.3”项下色谱条件测定。结果显示，没食子酸平均得率为2.572 5 mg.g-1，RSD值1.71%，说明优选的提取工艺科学合理，重现性好。

3 讨论

水煎服是贵州苗族集聚区采用铁苋菜治疗喘咳、腹泻、红白痢疾等症状的常用方法，煎煮工艺的合理性，直接决定或影响药物疗效的发挥。本研究结果表明，不同煎煮工艺参数对指标性成分的含量有影响，尤其是煎煮温度，水温越高越利于没食子酸的溶出。究其原因，可能与没食子酸的化学性质有关，没食子酸具有极强的亲水性，易溶于水、乙醇，尤其是沸水。

课题组前期的研究结果表明[6]，以乙醇为提取溶剂，采用回流法按优选的工艺参数提取，没食子酸平均得率(7.888 0 mg.g-1)显著高于本研究水煎法的得率(2.572 5 mg.g-1)。该结果提示，不同提取方法和工艺对铁苋菜中没食子酸提取率的影响显著，因而需要根据实际需求选择科学合理的提取方法和工艺。