药用辅料聚乙二醇6000 中醛类测定方法的比较研究

石蓉，谢莹莹，郑金凤，张悦，尹林高，刘雁鸣

1.湖南省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局药用辅料工程技术研究重点实验室，湖南 长沙 410001；2.湖南省药品审核查验中心，湖南 长沙 410001

聚乙二醇6000 是一种无毒、无刺激性的水溶性高分子聚合物，广泛应用于各种药物制剂中［1］。聚乙二醇6000 作为药用辅料主要应用于口服和外用制剂，可作为软膏、栓剂的基质，片剂、胶囊剂的润滑剂，增塑剂等［2］。聚乙二醇6000 现收载于《中国药典》2020 年版四部［3］。目前国内生产企业基本采用乙二醇或二甘醇为起始原料，在碱土金属催化剂的作用下与环氧乙烷聚合生产聚乙二醇6000［4-5］。该聚合物由多个氧乙烯基组成线性链状结构，两端各有1 个羟基，其自氧化过程会发生不同程度的断裂，产生醛类小分子物质，主要为甲醛和乙醛［6-7］。甲醛、乙醛化学性质活泼，可与核酸、蛋白质等发生交联，促进蛋白质羰基化，导致机体应激反应和损伤，从而诱发多种疾病，目前已被国际癌症研究组织认定为1 类致癌物［8］。《中国药典》2020 年版四部标准采用变色酸法对聚乙二醇6000的甲醛含量进行控制。GB/T 14571.3-2008《工业用乙二醇中醛含量的测定-分光光度法》中采用酚试剂法测定乙二醇中总醛含量［9］。现有文献中对低分子醛测定有多种方法，其中2，4 二硝基苯肼（以下称DNPH）柱前衍生-高效液相色谱法应用广泛［10-17］。故本研究通过采用变色酸法测定聚乙二醇6000 中甲醛含量，建立DNPH 柱前衍生-高效液相色谱法测定聚乙二醇6000 中甲醛、乙醛含量，参考GB14571.3-2008 采用酚试剂法测定聚乙二醇6000 中总醛含量这三种方法的比较研究，为药用辅料聚乙二醇6000 醛类测定的标准制修订提供参考和依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A 型高效液相色谱仪、PDA 检测器、LCSlution 数据工作站；AUW220D 型电子天平，UV-2550 型紫外分光光度计（均来自岛津有限公司）。

1.2 试药

水中甲醛溶液标准物质（批号为20211208，浓度为10 mg/mL），乙醛对照品（批号为22040034，纯度为99.7%），均购自坛墨质检-标准物质中心。2，4-二硝基苯肼（HPLC 级，批号为C10563969，纯度为98%，购自上海麦克林生化科技有限公司）。乙腈（色谱纯，购自默克公司）。盐酸、硫酸、氨基磺酸、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物（MBTH）、六水合三氯化铁、变色酸钠均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 变色酸法

参照《中国药典》2020 年版四部聚乙二醇6000 的甲醛项［3］测定方法进行试验，在567 nm 波长下测定供试品溶液和对照溶液吸光度，用同法操作的空白溶液进行校正。根据吸光度以外标法计算样品中甲醛含量。

分别制备甲醛对照溶液、乙醛对照溶液进行实验。用空白溶液校正后，结果甲醛对照溶液吸光度为0.468，乙醛对照溶液吸光度为0.002，说明该方法只能测定甲醛，专属性好。

2.2 DNPH 柱前衍生-高效液相色谱法

2.2.1 色谱条件 采用Waters XBridge C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-水（60∶40）为流动相等度洗脱20 min，检测波长为360 nm，流速1.0 mL/min，进样体积10 μL，柱温35 ℃。

2.2.2 溶液的制备 衍生化溶液：取经重结晶纯化后的2,4-二硝基苯肼0.25 g，精密称定，置50 mL 棕色量瓶中，加入20 mL 乙腈涡旋使部分溶解，再加入3 mL 盐酸迅速涡旋混匀，超声使溶解，用乙腈稀释至刻度，临用新制。

供试品溶液：取样品0.5 g，精密称定，置10 mL 棕色量瓶中，加入1 mL 乙腈，涡旋使样品溶解后，加入2 mL 衍生化溶液，涡旋混匀，30℃静置15 min，用乙腈稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm 有机滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

空白溶液：不加样品，按供试品溶液同法操作。

对照溶液：精密称取乙醛对照品0.05 g，置10 mL 量瓶，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得乙醛贮备液。分别精密量取甲醛标准溶液0.1 mL，乙醛贮备液1 mL，置同一100 mL 量瓶，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得对照混标贮备溶液。精密量取对照混标溶液1 mL，置10 mL 棕色量瓶中，自“加入2 mL 衍生化溶液…”按供试品溶液同法操作。

线性系列标准溶液：分别精密量取甲醛标准溶液0.4 mL，乙醛贮备液4 mL，置同一100 mL 量瓶，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得标准曲线贮备溶液。精密量取标准曲线贮备溶液适量，自“加入2 mL衍生化溶液…”按供试品溶液同法操作，得到线性系列标准工作溶液，详见表1。

表1 线性系列标准工作溶液 µg/mL

2.2.3 专属性试验 精密量取空白溶液、供试品溶液和对照溶液各10 μL 进样，记录色谱图，详见图1。结果空白溶液对测定无干扰，供试品溶液色谱图中甲醛-DNPH、乙醛-DNPH 峰保留时间与对照品主峰保留时间一致。

图1 DNPH柱前衍生-高效液相色谱图：A.空白溶液；B.对照品溶液、C.供试品溶液

2.2.4 线性关系、检出限、定量限、精密度与重复性试验 精密量取线性系列标准工作溶液各10 μL 进样，以浓度为X 轴，峰面积为Y 轴，绘制标准曲线。精密量取STD1 溶液1 mL 置10 mL 量瓶，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得检出限溶液。取上述溶液10 μL 进样，分别按S/N=3、S/N=10 计算检测限和定量限。取STD 6 溶液，重复进样6 次，计算峰面积RSD。取同一批样品按“2.2.2”项下方法制备6 份供试品溶液，进行重复性试验，结果详见表2。

表2 标准曲线、检出限、定量限、重复性与精密度试验结果

2.2.5 稳定性试验 取样品（自编号：J6）和对照贮备溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液和对照溶液，于室温放置0、2、4、8 h，分别取样10 μL 测定，以峰面积为考察指标，结果供试品溶液中甲醛-DNPH、乙醛-DNPH 峰面积的RSD 分别为0.86%、0.62%，对照溶液中甲醛-DNPH、乙醛-DNPH 峰面积的RSD 分别为1.55%、0.31%，说明供试品溶液和对照溶液在8 h 内稳定。

2.2.6 回收率试验 分别精密量取甲醛标准溶液1 mL，乙醛贮备液2 mL，置同一100 mL 量瓶，加乙腈稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1 mL，置20 mL 量瓶，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得回收标准溶液。取样品（自编号：J6）0.5 g，精密称定，置10 mL 量瓶中，加入1 mL 回收标准溶液，按“2.2.2”项下方法，自“加入2 mL 衍生化溶液…”同供试品溶液操作，平行制备6 份溶液。分别取样10 µL测定并计算回收率，结果甲醛、乙醛平均回收率分别为：98.16%、95.54%，RSD 分别为 2.0%、1.2%。说明方法的准确度良好。

2.3 酚试剂法

2.3.1 测定方法 参照GB/T 14571.3-2008《工业用乙二醇中醛含量的测定-分光光度法》中酚试剂法［9］测定聚乙二醇6000 中总醛。在620 nm 处测定供试品溶液和标准曲线溶液吸光度，用同法操作的空白溶液进行校正，根据吸光度以标准曲线法计算样品中总醛含量。

2.3.2 线性关系、检出限、定量限和重复性试验 取标准曲线系列溶液（0.1 µg/mL、0.2 µg/mL、0.4 µg/mL、0.6µg/mL、0.8 µg/mL、1.0 µg/mL），依法测定吸光度，以浓度为X 轴，吸光度为Y 轴，绘制线性标准曲线。取空白溶液，依法重复测定7 次，计算SD 值。以3 SD/标曲斜率，计算检出限；以10 SD/标曲斜率，计算定量限。取样品（自编号：J15）按供试品溶液同法操作，平行制备6 份供试品溶液，依法测定，结果详见表2。

2.3.3 加标回收试验 取样品（自编号：J15）9 份，各0.2 g，精密称定，分别置50 mL 量瓶中，分为三组，每组3 份，分别加入0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL对照贮备溶液，按供试品溶液同法操作，即得加标回收溶液。依法测定，结果低、中、高浓度水平的平均回收率分别为95.09%、99.18%、96.01%，RSD分别为0.66%、0.78%、0.85%，方法准确度良好。

2.4 样品测定

2.4.1 样品来源 共收集到聚乙二醇6000 样品36 批（为国家药品抽检品种，均为药用辅料级），来自7家生产企业，详细信息见表3。

表3 聚乙二醇6000醛含量测定结果比较 %

2.4.2 样品测定结果比较 分别采用上述三种方法，对36 批聚乙二醇6000 样品进行测定，结果比较表详见表3。变色酸法和高效液相色谱法测定甲醛含量比较图见图2，酚试剂法测定总醛含量和高效液相色谱法测定甲醛、乙醛总量比较图见图3。从以上图表可知，按变色酸法测定，36 批样品中甲醛含量为0.000 13%～0.002 05%，均小于法定检验限度（0.003%），符合规定。按高效液相色谱法测定，36 批样品中甲醛含量为0.000 05%～0.024 27%，乙醛含量为0.000 44%～0.023 21%，有4 批样品（编号：J1、J14、J18 和J26）的甲醛测定结果远超法定限度。按酚试剂法测定，36批样品中总醛含量为0.001 07%～ 0.052 75%。

图2 变色酸法和HPLC法测定甲醛含量比较图

图3 酚试剂法测定总醛含量和高效液相色谱法测定甲醛、乙醛总量比较图

为分析J1、J14、J18（来自A 企业）和J26（来自B 企业）这4 批样品两种方法甲醛测定结果不一致的原因，取样品J1、J26 和J5（来自C 企业，含量小于0.003%）各1 g，精密称定，分别加入1 mL甲醛溶液（30 μg/mL），按变色酸法制备样品加标回收溶液，在400～700 nm 紫外波长范围进行扫描。结果显示，样品J1、J26 均对标准溶液的显色有干扰，样品加标溶液在567 nm 处无最大吸收，而来自C 企业的J5 样品对标准溶液的显色无干扰，样品加标溶液在567 nm 处有最大吸收。

3 讨论

3.1 衍生化条件考察

采用DNPH 柱前衍生法进行样品处理，关键在于衍生液和衍生化过程。有文献［16］报道2，4-二硝基苯肼本身会带来甲醛、乙醛干扰。本研究对购买的HPLC 级2，4-二硝基苯肼进行重结晶纯化（称取2，4-二硝基苯肼5 g，置圆底烧瓶中，加入100 mL 乙腈，90 ℃水浴加热60 min 使溶解，60℃水浴中结晶，直到得到较大结晶，弃去上清液，用乙腈清洗结晶3 次，105 ℃干燥，即得），经过空白试验验证，可排除醛类干扰。同时，衍生液应临用新制，比较配制后1 h 和8 h 的衍生液处理样品和对照溶液。样品中的甲醛、乙醛含量分别下降12.20%和11.14%，对照溶液中的甲醛、乙醛含量分别下降7.05%和8.21%。衍生温度对衍生结果也有一定影响，分别考察30 ℃、40 ℃和50 ℃三个温度梯度，结果显示同一反应时长下，随着温度增高，对照溶液中甲醛、乙醛含量呈下降趋势。

3.2 三种醛类测定方法比较

本研究对聚乙二醇6000 中醛类测定方法进行了比较，结果表明除J1、J14、J18 和J26 这4 批样品外，变色酸法与高效液相色谱法测定的甲醛含量，高效液相色谱法测定的甲醛、乙醛总量和酚试剂法测定的总醛含量基本一致。

变色酸法是法定标准，该方法中变色酸和甲醛以浓硫酸为介质，生成紫色络合物，专属性好，但是该方法易受样品基质干扰，当样品中含有干扰显色物质时，比如其他醛类或杂质，样品在检测波长处无最大吸收，造成甲醛含量测定结果远低于其实际含量。本研究建立的DNPH 柱前衍生HPLC 法简便易操作，方法学验证结果表明方法可行，可用于聚乙二醇6000 中甲醛、乙醛含量测定。酚试剂法测定总醛含量的方法学验证结果符合要求，4 批样品（J1、J14、J18 和J26）总醛测定结果均高于HPLC 法测定甲醛、乙醛总量。推测可能是该4 批样品中含有其他醛类，导致测定结果偏高。故三种醛类测定方法中，通过HPLC 测定聚乙二醇6000中甲醛、乙醛含量不受样品干扰，测定结果更为准确，可以作为甲醛、乙醛定量分析方法，结合酚试剂测定总醛含量，可以从总体上控制药用辅料聚乙二醇6000 的醛类物质。