热休克蛋白90α在下肢深静脉血栓诊断中的应用价值*

石 娇，周叶园，张 婷，吴东明，许 颖△

1.成都医学院第一附属医院（成都 610500）；2.冕宁县疾病预防控制中心（凉山州 615600）

下肢深静脉血栓（lower extremity deep venous thrombosis，LDVT）是一种常见的周围血管疾病，病变主要累及下肢深静脉，其发病机制与静脉壁损伤导致的静脉炎、静脉血流滞缓和血液高凝状态等因素有关[1-2]。LDVT的发生同年龄、体重指数(body mass index，BMI）、长期吸烟等因素有关[3]。但由于其早期症状不明显，导致诊断难度系数较高；同时部分患者因骨折、制动、炎症反应等因素可引起肢体疼痛或肿胀等表现，极易发生漏诊或误诊[3]。LDVT如未得到及时有效的治疗，易出现肺栓塞、出血、继发深静脉瓣膜功能不全等并发症，严重影响患者的健康与生活质量[4]，因此对其进行早期诊断具有重要意义。

目前LDVT的诊断金标准是下肢静脉造影，但其属于有创性检查，且部分患者对造影剂过敏，导致下肢静脉造影无法作为筛查手段进行大范围应用[5]。随着超声检查技术的发展，彩色多普勒超声作为筛查LDVT的一种方法[6]，其诊断准确率为96.25%[7]，目前已成为临床常用的检测方法，但因其具有滞后性，无法提前预判血栓的形成[8]。现阶段临床实验室检测LDVT的主要指标有D-二聚体（D-dimer，D-D）、纤维蛋白（原）降解产物[fibrin（-ogen） degradation products，FDP]、纤维蛋白原（fibrinogen，Fib）等。有研究[9]表明，术后短期内并发LDVT的患者血浆Fib、D-D水平明显升高；而未并发LDVT的患者血浆Fib、D-D水平没有明显变化。但Fib、D-D等实验室指标的特异性和敏感度有待提高，尚未作为筛查手段进行大范围应用[10-11]。

热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一类热应激蛋白质，参与机体正常细胞生长、分化和代谢。维持内环境稳定的正常细胞中也含有低量的热休克蛋白90α（heat shock protein 90α，HSP90α），以维持细胞的正常生理功能。细胞在热刺激、炎症等应激条件下会启动HSP90α的合成与释放，以提高细胞应对各种刺激的能力[12]，促进细胞分泌血管生长因子和细胞基质等成分，提供细胞损伤修复所需营养物质，从而促进伤口恢复[13]。本研究拟探讨HSP90α在LDVT诊断中的价值，为临床早期诊断LDVT提供更多理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2019 年1 月至2021 年12 月于成都医学院第一附属医院确诊为LDVT的患者81 例作为试验组，同时随机选取同期于该院进行体检的健康体检者81 例作为对照组。纳入标准：1）符合临床多普勒超声诊断标准，即下肢静脉腔内有无-低-中-强的血栓回声；探头加压后，静脉腔不能压闭或部分压闭；彩色多普勒血流成像（color doppler flow imaging，CDFI）显示静脉腔内无彩色血流信号或血流信号不丰富，有明显的充盈缺损；血流频谱不随呼吸改变。2）试验组患者尚未经过药物治疗，避免药物对样本检测结果产生干扰。排除标准：1）诊断不明确；2）合并下肢静脉炎、下肢静脉曲张、风湿免疫相关疾病、消化系统疾病、心血管系统疾病、肿瘤等；3）对照组存在可引起LDVT的相关疾病。本研究经成都医学院第一附属医院伦理委员会审核、批准（批准号：2023CYFYIRB-BA-Jan04）。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性（表1）。

表1 两组一般资料比较[n（%），，n=81]

表1 两组一般资料比较[n（%），，n=81]

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1.2 试剂及仪器

HSP90α定量检测试剂盒购自烟台普罗吉生物科技发展有限公司；D-D测定试剂盒、FDP检测试剂盒、Fib测定试剂盒购自美国Instrumentation Laboratory。全自动酶标仪（无锡华卫德朗仪器有限公司，DR-200B）；全自动洗板机（Wellwash Versa）（美国Thermo Scientific，888）；全自动凝血分析仪（西班牙Werfen，ALC TOP700）。

1.3 方法

1.3.1 标本前处理 1）HSP90α样本处理：使用EDTA-K2 抗凝管（紫头管）采集全血2 mL，低速离心机下离心10 min（3 500 r/min，离心半径18.9 cm）后收集血浆样本，备用。2）D-D、FDP、Fib样本处理：使用枸橼酸钠抗凝管（蓝头管，1∶9 抗凝）采集全血2 mL，低速离心机下离心5 min（3 000 r/min，离心半径18.9 cm）后收集血浆样本，备用。

1.3.2 HSP90α、FDP、D-D、Fib测定 HSP90α水平测定采用酶联免疫吸附法，FDP、D-D水平测定采用免疫比浊法，Fib水平测定采用凝固法。严格按照仪器和试剂说明书进行实验操作和结果计算。

1.4 统计学方法

采用IBM SPSS Statistics 26.0 统计软件处理数据。符合正态分布的定量资料采用（）描述，组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的定量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。采用Logistic回归模型单因素和多因素分析各指标对LDVT的影响。检验水准α除特别说明外均设定为0.05。

2 结果

2.1 两组血浆HSP90α、FDP、D-D 和Fib 表达水平比较

试验组HSP90α水平、FDP水平、D-D水平和Fib水平均明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 两组血浆HSP90α、FDP、D-D和Fib水平比较[M（P25，P75），n=81]

2.2 试验组HSP90α 水平与指标相关性比较

本研究将试验组分为0～60岁及61～100岁2个年龄段（划分参照我国老年人年龄界定标准）。根据HSP90α检测试剂盒说明书，将试验组分为＜82.06 μg/L和＞82.06 μg/L 2个亚组。利用χ2检验分析血浆HSP90α水平与患者性别、年龄以及FDP、D-D、Fib各指标的相关性。结果显示：HSP90α水平与患者年龄和性别无相关性（P＞0.05）；HSP90α水平与FDP、D-D和Fib具有相关性（P＜0.05）（表3）。

表3 试验组 HSP90α水平与性别、年龄及FDP、D-D、Fib指标相关性比较[n（%）]

2.3 HSP90α、D-D、FDP、Fib 对LDVT 影响的单因素和多因素分析

将HSP90α、D-D、FDP、Fib分别作为自变量，以LDVT的发生情况作为因变量进行单因素Logistic回归分析，结果显示：FDP、D-D、Fib及HSP90α指标与LDVT的风险系数呈正相关（P＜0.05）。进一步将D-D、FDP、Fib与HSP90α联合构建多因素Logistic回归分析，结果发现：Fib和HSP90α可作为LDVT的独立预测因子（P＜0.05）（表4）。

表4 HSP90α、D-D、FDP、Fib对LDVT影响的单因素和多因素分析

2.4 HSP90α、D-D、FDP、Fib 诊断效能及HSP90α诊断临界值

通过绘制受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC）进一步分析HSP90α、FDP、D-D、Fib对于LDVT的诊断价值。ROC曲线显示，HSP90α、FDP、D-D、Fib用于诊断LDVT的曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.876、0.985、0.987、0.840（P＜0.05）。HSP90α、FDP、D-D、Fib 4 个指标均可作为LDVT的诊断指标，其中D-D的AUC最大，诊断效能最佳，HSP90α诊断效能优于Fib。进一步计算HSP90α诊断LDVT的最佳临界值，最佳临界值的确定采用约登指数（灵敏度+特异性-1）最大值时对应的表达量定义，计算得出HSP90α诊断LDVT的最佳临界值为55.55 μg/L（图1）。

图1 HSP90α用于诊断LDVT的ROC曲线

3 讨论

流行病学研究[14]显示，LDVT发病率呈逐年上升趋势，血流滞缓、静脉壁损伤和血液高凝均易导致LDVT的发生。LDVT患者中女性患病率（59.1%）高于男性（40.9%）[1]，且患病年龄逐渐年轻化。长期卧床患者LDVT的发病率可达31.0%[2]，40%～60%的患者术后7～14 d可发生LDVT，其中髋部骨折术后LDVT发病率高达40%～70%，即便接受抗凝治疗其发病率仍达到25%～30%[3]。现阶段临床用于LDVT的诊断方法主要有下肢静脉造影、多普勒超声；实验室检查指标主要有D-D、FDP、Fib。HSP90α属于HSPs90家族的亚类，也属于热应激反应蛋白。当机体受到冷、热、缺氧、感染、肿瘤等刺激时，机体会合成大量HSP90α。本课题组在日常HSP90α检验报告审核中发现，HSP90α在肿瘤患者和LDVT患者的血浆中表达量升高，进一步收集LDVT患者HSP90α结果和相关临床资料，探索并评价HSP90α作为LDVT辅助诊断指标的意义及价值。

本研究试验组患者HSP90α、FDP、D-D、Fib水平均较对照组明显增高（P＜0.05）。虞亚菲等[15]研究发现，D-D水平可反映体内凝血和纤溶过程的变化，是血栓形成或溶解的重要标志，血栓形成过程中D-D表达水平会明显升高，这与本研究试验组D-D水平明显高于对照组的研究结论一致。张玥等[16]研究表明，Fib、FDP是LDVT发生的独立危险因素，提示LDVT患者继发性纤溶活性增强，此时机体处于高凝状态，即血栓形成时，会伴有血浆中FDP、Fib等表达水平的增高，本研究结论与张玥等[16]研究结论一致。HSP90α的升高可能与静脉壁受损后静脉血管内皮受到损害，致使血管内皮功能紊乱有关；此时凝血酶被激活，机体的凝血和抗凝血功能失衡，促使血栓形成；同时远端血液回流受阻，导致远端静脉压力升高，毛细血管渗透压增高，血管内液渗透至组织间隙，致肢体肿胀、缺氧、发热并伴有炎性因子的释放[17-18]，当细胞处于应激情况时，会启动HSP90α的合成和释放，以提高细胞应对各种刺激的能力[12]，促进细胞分泌血管生长因子和细胞基质等成分，提供细胞损伤修复所需营养物质，促进伤口恢复[13]。

本研究单因素logistic回归分析显示，FDP、D-D、Fib和HSP90α均与LDVT的风险系数呈正相关（P＜0.05），FDP表达量越高，发生LDVT的概率越大，其次为Fib、D-D和HSP90α。多因素logistic回归分析显示， Fib、HSP90α是LDVT发生的危险因素，二者可作为LDVT的独立预测因子。杨勇等[19]研究报道，D-D诊断LDVT的敏感度为86.6%～98.0%，特异度为54.6%～58.6%，血浆D-D是体内交联纤维蛋白在纤溶酶作用下降解片段中的特异产物，其含量升高可反映继发性纤溶活性增强，是体内高凝状态和纤溶亢进的指标之一，在被纤溶系统溶解时将释放至血液循环系统[20]。LDVT形成时，机体处于高凝状态，会导致血浆D-D水平增高，本研究中D-D对LDVT具有较高诊断价值的结论与杨勇等[19]研究一致。丁红辉[21]研究指出，FDP是血栓形成和高凝状态的重要临床指标，Fib可反映血液黏稠度，当机体形成的血栓处于高凝状态时，血浆中FDP、Fib水平会明显升高，促进红细胞聚集，降低血液流动性[22]，可作为诊断LDVT的指标，这与本研究中Fib、FDP对LDVT具有较高诊断价值的结论相一致。本研究ROC曲线显示，HSP90α用于诊断LDVT的AUC为0.876（P＜0.05），且诊断LDVT的最佳临界值为55.55 μg/L。既往研究中，尚未发现血浆中HSP90α表达水平与LDVT相关的报道。

综上所述，HSP90α表达水平在LDVT患者血浆中显著升高，可作为LDVT的独立预测因子，因此检测血浆中HSP90α水平对LDVT具有重要的临床诊断价值。但具体的影响机制有待进一步研究，未来将深度探究影响血浆中HSP90α水平变化的机制，为LDVT的精准诊断提供依据。