灵芝总三萜富集用不同型号大孔吸附树脂的筛选

陈婧 罗欣 钟海燕 刘泽浈 李鹏

（福建医科大学药学院 福州 350122）

赤芝[Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.]为多孔菌科真菌的干燥子实体，是一种传统中药材，使用历史非常悠久[1]。灵芝含有三萜、多糖、生物碱、黄酮、甾醇、蛋白质、氨基酸等多种类型的化学成分[2]。羊毛甾烷型四环三萜类成分是其主要的生物活性成分之一，具有抗肿瘤、抗炎、保肝、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗辐射、逆转肿瘤多药耐药等多种药理作用[3]。大孔吸附树脂已广泛用于富集药用真菌的有效成分，如核苷类、黄酮类、生物碱类、三萜类、酚类、蛋白质和肽类[4]。近年来，大孔吸附树脂已有用于灵芝三萜类物质分离纯化工作。周晓[5]利用AB-8树脂对灵芝三萜粗提液进行分离纯化。陈慧[6]和王涛[7]选取ADS-8大孔树脂用于灵芝三萜的分离纯化。但是关于灵芝总三萜富集用的大孔吸附树脂的筛选研究报道较少。针对文献中已用于三萜类物质纯化的8种大孔吸附树脂（HPD400、HPD500、D101、D4020、LSA-21、DM301、HZ816及HP-20），本研究比较这些树脂对灵芝总三萜的吸附与解吸附能力，从中筛选出用于富集灵芝总三萜的合适树脂，为后续利用大孔吸附树脂纯化灵芝三萜的研究工作奠定基础。

1 材料和方法

1.1 仪器、试剂与材料

ZQTY-50振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司）；Cary 300紫外可见分光光度计（安捷伦科技有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；R-100旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）；SHB-III循环水式多用真空泵（福州泰美实验仪器有限公司）；XS105型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

大孔吸附树脂购自上海源叶生物科技有限公司，型号规格详见表 1；95%乙醇、乙酸乙酯、甲醇（AR，国药集团化学试剂有限公司）；冰醋酸（AR，西陇科学股份有限公司）；高氯酸（AR，成都金山化学试剂有限公司）；香草醛（AR，上海麦克林生化科技有限公司）；齐墩果酸对照品（AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；赤芝药材（福建仙芝楼生物科技有限公司提供，经福建医科大学药学院天然药物学系张永红教授鉴定，药材标本现存于福建医科大学福建省天然药物药理学重点实验室）。

表1 实验所使用的苯乙烯型大孔吸附树脂的一般性能

1.2 实验方法

1.2.1 灵芝总三萜母液的制备

准确称取灵芝粉末500 g于5 000 mL的圆底烧瓶中，加入3 000 mL 95%乙醇，95 ℃回流提取3次，每次2 h。合并3次提取液并过滤，滤液减压浓缩，真空干燥，称重，得醇提浸膏（24.47 g）。将醇提浸膏用60%乙醇溶解，并定容至1 000 mL，即得灵芝总三萜母液。

1.2.2 灵芝总三萜含量测定

1）标准曲线的绘制 参考2020版《中国药典》灵芝项下三萜含量测定方法[8]，精密称取干燥至恒重的齐墩果酸对照品5.0 mg于25 mL量瓶中，加甲醇溶解后，定容至刻度，配制成0.2 mg/mL的对照品溶液。分别吸取对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分别置于5 mL具塞试管中，不加塞，水浴挥干溶剂，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL及高氯酸0.8 mL，加塞，摇匀，在70 ℃恒温水浴中加热15 min后，立即置冰水浴中冷却5 min，再加入乙酸乙酯使总量为5 mL，摇匀，以相应试剂为空白，在546 nm处测定吸光度。以吸光度值(A)为纵坐标，齐墩果酸浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线。

2）精密度测定 取0.02 mL灵芝总三萜母液于5 mL具塞试管中，水浴挥干溶剂后，按 “1.2.2项1）标准曲线的绘制”的方法，测定其吸光度6次。

3）稳定性测定 取0.02 mL灵芝总三萜母液于5 mL具塞试管中，水浴挥干溶剂后，按 “1.2.2项1）标准曲线的绘制”的方法，分别在室温下放置5、10、15、20、25、30、35、40、45 min后测定其吸光度。

4）重复性测定 取0.02 mL灵芝总三萜母液6份，分别置于编有1、2、3、4、5、6号的5 mL具塞试管中，水浴挥干溶剂后，按“1.2.2项1）标准曲线的绘制”的方法，测定其吸光度。

5）回收率测定 取0.02 mL灵芝总三萜母液6份，分别置于编有1、2、3、4、5、6号的5 mL具塞试管中，在1、2号管中加入0.1 mL齐墩果酸对照品，在3、4号管中加入0.15 mL齐墩果酸对照品，在5、6号管中加入0.2 mL齐墩果酸对照品，分别摇匀，水浴挥干溶剂后，按“1.2.2项1）标准曲线的绘制”的方法，测定其吸光度（齐墩果酸对照品浓度为0.22 mg/mL）。

回收率（%）=（C－A)/B×100%。

式中：A为加入样品量(mg)，B为加入标准品量(mg)，C为测得量(mg)。

6）母液中灵芝总三萜含量测定 精密移取灵芝总三萜母液0.02 mL于5 mL具塞试管中，不加塞，挥干溶剂，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL及高氯酸0.8 mL，加塞，摇匀在70 ℃恒温水浴中加热15 min后，立即置冰浴中冷却5 min，再加入乙酸乙酯使总量为5 mL，摇匀，以相应试剂为空白，在546 nm处测定吸光度，将吸光度值（A）代入回归方程，计算灵芝总三萜母液中总三萜的含量，平行实验3次。

1.2.3 静态吸附-解吸实验

1）大孔吸附树脂预处理 各型号大孔吸附树脂用95%乙醇浸泡24 h，待溶胀完全后，湿法装柱，用95%乙醇洗脱直至溜出液与蒸馏水按体积比1∶4混合后不呈现白色浑浊，然后用大量的蒸馏水洗脱，直至溜出液无醇味，湿法密封保存待用。

2）静态吸附考察 准确量取预处理过的大孔吸附树脂HPD400、HPD500、D101、D4020、LSA-21、DM301、HZ816及HP-20各10 mL于250 mL锥形瓶中，分别准确量取灵芝总三萜母液30 mL加于各锥形瓶中，另量取30 mL灵芝总三萜母液于250 mL锥形瓶（不含树脂）作为空白对照组，用保鲜膜和胶布封口后，置于振荡培养箱中，100 r/min，25 ℃，振摇24 h，抽滤，滤液备用。各取滤液0.04 mL，按“1.2.2项6）母液中灵芝总三萜含量测定”的方法，分别测定空白对照组与各型号大孔吸附树脂吸附后滤液中灵芝总三萜的含量，计算各大孔吸附树脂对灵芝总三萜的吸附量和吸附率。

吸附量＝空白对照组中总三萜含量－滤液中总三萜含量；吸附率＝(空白对照组中总三萜含量－滤液中总三萜含量)/空白对照组中总三萜含量×100%。

3）静态解吸考察 将“1.2.3”项2）中通过过滤得到的已吸附灵芝三萜的8种树脂分别完全转移入250 mL锥形瓶中，再分别加入50 mL的95%乙醇，用保鲜膜和胶布封口后，置于振荡培养箱中，100 r/min，25 ℃，振摇24 h，抽滤，滤液备用。各取滤液0.08 mL，按“1.2.2项6）母液中灵芝总三萜含量测定”的方法，测定各型号大孔吸附树脂解吸附后对应滤液中灵芝总三萜的含量，计算解吸率。

解吸率（%）＝解吸后滤液中总三萜的含量/吸附量×100%。

2 结果

2.1 灵芝总三萜母液中总三萜含量

2.1.1 精密度测定

结果表明，仪器精密度良好（表2）。

表2 精密度测定

2.1.2 稳定性测定

结果表明，在样本配制后5～45 min内进行测定，稳定性良好（表3）。

表3 稳定性测定

2.1.3 重复性测定

结果表明，方法重复性良好（表4）。

表4 重复性测定

2.1.4 回收率测定

结果表明，方法回收率良好（表5）。

表5 回收率测定

2.1.5 灵芝总三萜母液中总三萜含量

齐墩果酸浓度于4～20 μg/mL范围内与其吸光度值线性关系良好，其标准曲线回归方程为A=0.011 8+0.032 67C，r=0.999 5。经3次重复实验，测得灵芝总三萜母液中总三萜平均含量为2.46 mg/mL（表6）。样品测定前，我们考察了母液中的非三萜有色物质是否会干扰测定结果。取0.02 mL母液于5 mL具塞试管中，再加入无水乙醇使总量为5 mL，摇匀，以相应试剂为空白，在546 nm波长处测定吸光度为0.003，因此，母液中的非三萜类有色物质不会对三萜的测定产生干扰。

表6 灵芝总三萜母液中总三萜浓度

2.2 静态吸附-解吸实验

根据计算公式得出8种大孔吸附树脂吸附率和解吸率。结果表明，HPD400大孔吸附树脂的吸附率（67.27%）和解吸率（97.5%）均较高（图1），因此，综合考虑，选择其用于灵芝总三萜的富集工作。

图1 不同型号大孔吸附树脂对灵芝总三萜的静态吸附-解吸率（n=3）

3 讨论

灵芝是一种既可作为食物又可作为药物使用的物质。近年来，大孔吸附树脂已有用于灵芝三萜类物质分离纯化工作。选择合适的树脂是开展利用大孔吸附树脂纯化灵芝三萜研究工作的基础。钱竹等[9]用大孔树脂从发酵液中分离提取灵芝三萜类物质，并比较了4种大孔吸附树脂AB-8、S-8、NKA-9和HP-20。结果发现，AB-8树脂最适合于灵芝三萜的分离和纯化。段晓颖等[10]通过乙醇回流提取灵芝子实体中的灵芝总三萜成分，再利用大孔吸附树脂富集，实验比较了HPD100、HPD300、HPD400、HPD600、D101、AB-8、X-5、HPD-BJQH和S-8这9种大孔吸附树脂对灵芝总三萜的富集效果，结果选择HPD400来富集灵芝总三萜。通过大孔吸附树脂静态吸附-解吸实验，本实验进一步比较了HPD400与HPD500、D101、D4020、LSA-21、DM301、HZ816、HP-20对灵芝总三萜的吸附和解吸作用，证实HPD400是较理想的大孔吸附树脂。

大孔吸附树脂的比表面积是影响树脂吸附性能的重要因素[11]。与LSA-21型大孔吸附树脂相比，在极性类型和树脂结构相同，平均孔径相当的情况下，比表面积更大的HZ816型树脂显示了更高的吸附率。但过高的比表面积，可能使HZ816型树脂吸附更多的杂质，从而干扰灵芝三萜的解吸，结果HZ816型树脂的解吸率反而明显低于LSA-21型树脂。因此，合适的大孔吸附树脂比表面积是纯化灵芝总三萜的关键因素之一。树脂的孔径和极性等也是影响树脂吸附性能的重要因素，这些因素最终影响到大孔树脂对所纯化物质的吸附率和解吸率。通过比较这些树脂对灵芝三萜的吸附率和解吸率，鉴于HPD400大孔吸附树脂同时具有较高的吸附率和解吸率，因此最终选择其用于后续灵芝总三萜的富集纯化工作。