温度和酸性环境对A型塞内卡病毒稳定性的影响

胡振儒, 赵司淼, 周回迎, 覃 尧, 冉旭华, 闻晓波

(海南大学动物科技学院, 海口 570228)

A型塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)作为猪水疱传染病病原体之一, 2014年以来陆续在北美、南美及亚洲报道了相关疫情[1]。2015年我国广东省报道首例因SVA感染的病例[2], 随后在福建、山东、广西等14个省份相继出现SVA感染的报道,表明该病在我国逐渐呈现出区域流行趋势,需重点加强对SVA的免疫防治工作[3]。鉴于SVA感染引起的新发传染病在我国境内快速传播,研发SVA疫苗保证高效接种才是防控传染病的关键[4]。然而无论是灭活疫苗、减毒活疫苗还是病毒颗粒样疫苗,疫苗效力与疫苗制剂中完整颗粒含量有关。完整的病毒颗粒受温度变化或pH值降低的影响,病毒颗粒不可逆的裂解为五聚体,既减弱疫苗的免疫原性,也降低疫苗的质量。因此,病毒颗粒稳定性是研发高效疫苗的一个关键性因素,有助于提高免疫效力,延长免疫持续时间[5-6]。在小RNA病毒科中,如口蹄疫病毒[7]、脊髓灰质炎病毒[8]、肠道病毒[9]等多数小RNA病毒均具有热与酸的不稳定性。研究[10]表明同为小RNA病毒科的甲型肝炎病毒具有热与酸稳定性,甚至在高达80 ℃环境中或pH值<2.0的酸性溶液下仍能保持完整的病毒颗粒。所以仅从病毒分类上无法判断SVA在温度和酸性环境中是否具有稳定性。

目前,已知SVA是小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员[11], 属于无包膜、单股正链RNA病毒, SVA基因组约7 300 bp, 仅包含1个开放阅读框(ORF), 编码1个多聚蛋白,经蛋白酶水解后加工形成结构蛋白与非结构蛋白。其中VP1、VP2、VP3、VP4 4个结构蛋白构成20面体结构,具有两重轴、三重轴和五重轴[12]。相关研究表明病毒颗粒的稳定性主要受衣壳蛋白的影响,衣壳蛋白上的静电相互作用及氢键与弱疏水相互作用等非共价相互作用网络在自身组装、结构完整性与稳定性方面起着关键性作用[13]。然而,衣壳蛋白仅有部分界面残基参与到组装过程中,蛋白质相互作用界面上的残基所形成的非共价相互作用结合能不均匀分布,导致这一部分热点残基贡献出大部分结合能的现象。在高温或酸性环境影响下,使衣壳蛋白中的热点残基提供的静电相互作用力、氢键与盐桥等稳定因素受到影响,病毒颗粒进而发生构象变化、裂解丧失病毒感染性,从而影响免疫原性[14]。相关研究[15]表明, FMDV衣壳亚基间氨基酸侧链对颗粒稳定性和病毒的功能影响较大。所以热点残基在病毒颗粒稳定性方面的显著贡献,对了解SVA的热稳定性与酸稳定性,以及后续热稳定机制研究具有重要意义。

本研究使用生物信息学软件对SVA衣壳蛋白的理化性质、衣壳蛋白间的热点残基与作用关系进行深入分析,推测病毒衣壳蛋白在热或酸性环境下具有不稳定性; 通过在特定温度与酸性环境下孵育SVA病毒液,使用TCID50检测SVA病毒滴度,使用RT-qPCR对SVA RNA拷贝数进行定量,探究温度和酸性环境对SVA稳定性的影响,为后续SVA疫苗的研发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 SVA衣壳蛋白稳定性生物信息学分析

1.1.1 SVA衣壳结构五聚体亚基理化特性分析

使用ProtParam或ProtScale服务器计算SVA衣壳蛋白(PDB:3CJI)的理化性质,包括亲水性指数(GRAVY)、脂肪族指数、稳定性指数等参数计算; 使用ChimeraX 1.4分析SVA衣壳蛋白的三维结构;使用I-Mutant 3.0进行残基突变分析。具体方法参照文献[16]。

1.1.2 热点残基与蛋白质相互作用残基分析

通过3个热点残基预测在线服务器PredHS、PPCHECK与KFC-2分析SVA衣壳蛋白热点残基。判定热点残基原则为SVA衣壳蛋白数据提交至上述3个热点残基分析网站,当被2个网站同时识别才判定为热点残基。而后将SVA衣壳蛋白数据提交至蛋白质相互作用、表面和组装(jsPISA)网络服务器上,识别SVA衣壳蛋白间相互作用网络。具体方法参照文献[17]。

1.2 SVA热稳定和酸稳定试验材料

1.2.1 细胞与病毒

SVA与IBRS-2细胞由海南大学动物科技学院动物医学实验室保存。

1.2.2 主要试剂与仪器

胎牛血清(FBS)为美国Invigentech公司产品; TRIzol Reagent、2×SYBR Green qPCR Mix试剂为北京兰杰柯科技公司产品; Random hexamer、RNase-free ddH2O、5×HiScript II Buffer、dNTP Mix、HiScriptⅡ反转录酶、RNA酶抑制剂为南京诺唯赞生物科技公司产品。实时荧光定量PCR仪(型号qTOWER 3)为德国Analytik公司产品。

1.3 SVA热稳定和酸稳定试验方法

1.3.1 细胞培养

IBRS-2细胞使用DMEM培养基(含10% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素)置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养,后续用于病毒培养与组织细胞半数感染量(TCID50)测定。

1.3.2 热稳定和酸稳定试验

将SVA病毒液设为温度处理组与酸性环境处理组,其中未处理SVA病毒液作为对照组。温度处理组孵育过程: 分别在4 ℃孵育4、8、15 d, 25 ℃孵育2、4、8 d, 37 ℃孵育8、16、48 h。酸性环境处理组孵育过程: SVA病毒液分别在pH 4.0、5.8的柠檬酸盐缓冲溶液和pH 6.6、7.2的磷酸盐缓冲溶液中以1∶9的比例孵育1 h, 后续用于TCID50测定病毒滴度变化。

1.3.3 病毒滴度测定

温度处理组、酸性环境处理组和对照组用DMEM培养基进行10倍稀释, 取10-1～10-10共10个稀释度分别接种于长满单层IBRS-2细胞的96孔培养板上, 每个稀释度以每孔0.1 mL接种8孔,其中以DMEM培养基(含2% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素)作为阴性对照、未稀释病毒液作为阳性对照。经37 ℃、5% CO2细胞培养箱孵育1 h后, 弃病毒液后用0.01 mol·L-1PBS缓冲溶液(pH 7.2)漂洗2次, 每孔加入0.1 mL DMEM培养基(含2% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素)。每天观察并记录细胞病变情况,按照Reed-Muench方法计算TCID50[18], 同一样品进行3次独立的病毒滴度检测。

1.3.4 引物设计与合成

参考SVA/HB/2018毒株的VP1基因序列(登录号为MN922286),设计1对特异性引物,上游引物序列为5′-TGGACTGGACATCGTATA-3′, 下游引物序列为5′-TTGCGTAGTAATTGAAGGT-3′。

1.3.5 总RNA提取及cDNA获取

将SVA分别经温度和酸性缓冲液孵育后,取100 μL病毒液接种到6孔细胞培养板上, 经37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育2 d, 提取SVA感染细胞后总RNA。利用反转录酶等试剂将总RNA反转录成cDNA, 具体操作参照文献[19]。

1.3.6 RT-qPCR检测及标准曲线的建立

以SVA cDNA为模板进行RT-qPCR检测。PCR反应体系中, 2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL, 上、下游引物各0.6 μL, cDNA模板0.4 μL, 加ddH2O至20 μL。反应条件: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 10 s, 52 ℃ 30 s, 共40个循环。每个样品做2个重复, 同1个样品进行3次独立的荧光定量PCR检测。

以本实验室构建的pcDNA3.1-VP1重组质粒为标准质粒,经10倍稀释后,以拷贝数对数值为结果绘制标准曲线。病毒基因组拷贝数计算公式如下: 拷贝数/copies·μL-1=6.02×1014×质粒浓度(ng·μL-1)/[(质粒分子量+插入片段分子量)×660]。检测标准质粒浓度为380.40 ng·μL-1, 质粒分子量加上插入片段分子量为6 250 bp, 则拷贝数初始值为5.55×1010copies·μL-1。

1.4 数据及统计学分析

使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析及作图,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)处理不同时间点的SVA RNA拷贝数,P<0.05表示差异显著,具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 SVA衣壳蛋白生物信息学分析

2.1.1 SVA结构分析

分析SVA衣壳蛋白结构(图1)时,发现部分组氨酸在五聚体界面处,如VP3中127 H、106 H与108 H以及VP2中197 H, 增加五聚体界面处的不稳定性[7]。使用I-Mutant 3.0服务器在默认参数下将VP3中127 H突变为R、106 H 突变为R, 则自由能变化值(DDG)>0.5, 说明蛋白质间稳定性得到极大提升。此外,将VP1中158 H突变为K时, DDG>0, 则增加衣壳蛋白间稳定性。

2.1.2 理化性质分析

对SVA衣壳蛋白理化性质分析结果(表1)显示, SVA衣壳蛋白中VP1与VP4为碱性(PI>7), VP2与VP3为酸性(PI<7), 其中VP1不稳定指数>40, 说明VP1并不稳定。此外, VP1—VP4中亲水性总平均值<0、芳香族占比<13.5、形成少量盐桥,表明VP1—VP4均为稳定性较差的亲水性蛋白质,且除VP2外,脂肪族指数均低于80, 意味着衣壳蛋白的耐热性较低。

2.1.3 SVA衣壳蛋白热点残基和相互作用预测

分析衣壳蛋白间的热点残基有助于了解病毒衣壳蛋白的稳定性。本研究对SVA衣壳蛋白的热点残基进行了识别,结果 (表2)显示,在VP1—VP4上分别检测到16、11、16和5个热点残基。通过PISA蛋白相互作用分析, SVA衣壳蛋白的多数热点残基在界面处与相邻残基形成氢键,少数热点残基形成盐桥,且至少以1种相互作用力参与到衣壳界面上,但缺少二硫键与范德华力等相互作用力[17,20]。

通过SVA衣壳蛋白间理化性质、热点残基及相互作用力的分析,推测SVA在高温或酸性环境中具有热不稳定性或酸不稳定性。

2.2 热稳定性试验

为验证SVA具有热不稳定性的推测,将SVA病毒液分别在4、25、37 ℃条件下处理不同时间,检测病毒滴度的变化。对照组SVA病毒滴度为108.8TCID50·mL-1, 4 ℃处理4、8、15 d, 病毒滴度分别下降100.66、101.14、102.35TCID50·mL-1(图2.A)。25 ℃处理2、4、8 d, 病毒滴度分别下降102.34、102.64、103.56TCID50·mL-1(图2.B)。37 ℃处理8、16、48 h, 病毒滴度分别下降100.85、101.57、104.65TCID50·mL-1(图2.C)。当SVA病毒液在不同温度下孵育时间延长时, SVA病毒滴度均有不同程度的下降,说明SVA对外界环境中的温度较敏感(P<0.05)。

图2 SVA在4 (A)、25 (B)、37 ℃ (C)孵育后的病毒滴度变化☆Fig.2 The viral titer changes of SVA after incubation at 4 (A), 25 (B), and 37 ℃ (C)☆ A. 经4 ℃孵育后SVA病毒滴度下降; B. 经25 ℃孵育后SVA病毒滴度下降; C. 经37 ℃孵育后SVA病毒滴度下降。与CK相比, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.000 1。☆ A. The virus titer of SVA decreased after incubation with 4 ℃; B. The virus titer of SVA decreased after incubation with 25 ℃; C. The virus titer of SVA decreased after incubation with 37 ℃. Compared with CK, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.000 1.

为进一步确认温度对SVA RNA拷贝数的影响,采用RT-qPCR检测经不同温度孵育后的SVA病毒液在IBRS-2细胞中的RNA拷贝数情况。绘制的标准曲线为Y=-0.996 8X+38.235, 决定系数R2=0.996 8, 说明具有良好线性关系[Y值为 cycle threshold (Ct值),X值为拷贝数对数]。对照组SVA拷贝数对数值为30.11; 4 ℃处理4、8、15 d, 拷贝数对数值分别为30.07、28.61、8.12 (图3.A); 25 ℃处理2、4、8 d后, 拷贝数对数值为25.43、22.52、14.36 (图3.B); 37 ℃处理8、16和48 h后, 拷贝数对数值为28.64、26.19、22.53 (图3.C)。SVA病毒液在不同温度下孵育时间延长时, SVA RNA拷贝数显著下降,导致病毒复制降低。病毒滴度与RNA拷贝数结果说明SVA具有热不稳定性(P<0.05)。

图3 SVA在4 (A)、25 (B)、37 ℃ (C)孵育后的拷贝数对数值☆Fig.3 Log copies value of SVA after incubation at 4 (A), 25 (B), and 37 ℃ (C) ☆ A. 经4 ℃孵育后的SVA拷贝数对数值变化; B. 经25 ℃孵育后的SVA拷贝数对数值变化; C. 经37 ℃孵育后的SVA拷贝数对数值变化。与CK相比, ns P>0.05, * P<0.05, *** P<0.001, **** P<0.000 1。☆ A. The log value of the number of SVA copies decreased after incubation with 4 ℃; B. The log value of the number of SVA copies decreased after incubation with 25 ℃; C. The log value of the number of SVA copies decreased after incubation with 37 ℃. Compared with CK, ns P>0.05, * P<0.05, *** P<0.001, **** P<0.000 1.

2.3 酸稳定性试验

为验证SVA具有酸不稳定性的推测,将SVA病毒液分别在不同pH值的柠檬酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液中孵育1 h, 检测病毒滴度的变化。由图4.A可见,对照组病毒滴度为108.42TCID50·mL-1; 在pH 4.0、5.8的柠檬酸盐缓冲液中孵育1 h, 病毒滴度分别为104.90、105.79TCID50·mL-1; 在pH 6.6、7.2的磷酸盐缓冲液中孵育1 h, 病毒滴度分别为106.68、107.60TCID50·mL-1。SVA病毒液孵育随pH值的上升, SVA病毒滴度接近对照组病毒滴度,说明SVA对酸性环境较敏感(P<0.05)。

图4 SVA在不同pH值孵育后的病毒滴度(A)与拷贝数对数值(B)☆Fig.4 The viral titer (A) and log value of copies number (B) of SVA after incubation in selected pH☆ A. 不同pH值缓冲液孵育后的SVA病毒滴度下降; B. 不同pH值缓冲液孵育后的SVA拷贝数对数值下降。与CK相比, **** P<0.000 1。☆ A. The virus titer of SVA decreased after incubation with a buffer solution of selected pH values. B. The log value of the number of SVA copies decreased after incubation with buffer solutions with selected pH values. Compared with CK, **** P<0.000 1.

为进一步确认酸性环境对SVA RNA拷贝数的影响,将SVA病毒液在不同酸性缓冲液中孵育1 h, 通过RT-qPCR检测SVA的RNA拷贝数。由图4.B可见,对照组拷贝数对数值为22.31; SVA在pH 4.0、5.8的柠檬酸盐以及在pH 6.6、7.2的磷酸盐缓冲液中孵育1 h, SVA RNA拷贝数对数值分别为11.58、13.81及16.31、17.06, SVA病毒液在酸性环境孵育后,病毒颗粒稳定性受到影响。病毒滴度和RNA拷贝数结果说明SVA具有酸不稳定性(P<0.05)。

3 讨论

自2007年美国报道首例SVA感染以来,我国的塞内卡病疫情形势日益严峻。据报道,我国半数省份发现SVA感染的情况[3], 随着SVA的流行导致毒株间的基因组变异与重组现象,加剧新毒株的形成与流行,进一步阻碍高效疫苗的研发,同时SVA持续的遗传进化会增加毒力返强的风险[21]。因此,需要持续跟踪监测SVA的流行情况,制订合理防疫政策并开发安全高效的疫苗。分析SVA的酸和热稳定性,为病毒培养、疫苗研发、运输和储存等提供一定的数据支持。本研究结果表明SVA具有酸和热不稳定性,与小RNA病毒科中的甲型肝炎病毒不同,但与同科的口蹄疫病毒、脊髓灰质炎病毒及泰勒式鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)表现出相似特性。接种疫苗是预防传染病的有效措施,病毒的稳定性对高效疫苗研发与应用至关重要。酸性和温热环境严重影响口蹄疫病毒、脊髓灰质炎病毒等小RNA病毒的稳定性,进而影响疫苗质量和机体免疫应答的诱导[22]。因此在灭活疫苗、减毒活疫苗等传统疫苗研发中,提高病毒的热和酸稳定性是提高疫苗质量和维持高免疫原性的前提[6]。鉴于衣壳结构是热和酸稳定性的重要影响因素,本研究在对SVA衣壳蛋白结构分析时,发现大量组氨酸位于SVA五聚体界面处,组氨酸残基质子化诱导的静电斥力和相邻五聚体之间的弱相互作用力可降低衣壳蛋白的稳定性[7]。理化性质分析表明VP1具有不稳定性且耐热性较差,而VP2—VP4较为稳定但耐热性依次递减。此外, SVA衣壳蛋白间的热点残基较少,残基间仅形成氢键和盐桥。与泰勒式鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)相比,不仅SVA衣壳蛋白间的热点残基数少于泰勒式鼠脑脊髓炎病毒,而且相互作用力也弱于后者[17]。据此推断,在温热或酸性环境下, SVA衣壳蛋白间的相互作用力受到影响,导致病毒颗粒稳定性下降。

温热或酸性环境变化可使衣壳蛋白变性,影响病毒衣壳蛋白的结构完整性。张燕红等[23]在热稳定性试验中发现,将SVA在37、50 ℃等温度下孵育较短时间后,病毒效价明显下降。本研究在4、25 ℃等温度下孵育较长时间,发现病毒效价以及在细胞中病毒RNA拷贝数均呈下降趋势,表明SVA由于衣壳蛋白结构发生改变,从而影响病毒与受体结合,不能有效进入细胞。Strauss等[24]在对SVA病毒颗粒在磷酸盐缓冲液进行酸稳定性测试时,发现pH<5.0的缓冲溶液中,病毒颗粒全部裂解成12S亚基,影响病毒的侵入和繁殖,本研究检测的酸处理后病毒滴度减少的结果与此一致。然而,张燕红等[23]在酸稳定性试验中发现SVA具有耐酸性。也有研究[9]发现钠盐在小RNA病毒中产生很强的衣壳稳定作用,导致SVA酸稳定试验结果出现差异。Cao等[25]使用冷冻电镜观察到酸孵育后的SVA中VP1 GH环和 VP3 GH环的结构发生变化,导致衣壳蛋白间的相互作用减弱,衣壳蛋白间的稳定性降低。Liu等[26]使用新型灭活剂β-丙内酯(BPL)制备SVA灭活疫苗,发现0.3%～0.5% BPL形成的酸性环境会导致病毒颗粒含量下降,影响疫苗的免疫保护效力。综上,在SVA疫苗生产过程中可采用改造抗原或添加保护剂等方法提高病毒颗粒的稳定性。

小RNA病毒的快速进化使不同毒株在理化性质和热点残基上可能存在差异,后续研究将进一步分析。同时,本研究使用重组质粒绘制标准曲线进行绝对定量,质粒模板与SVA cDNA模板的扩增效率可能存在一定差异[27], 但并不影响总体趋势的判断。总之, SVA衣壳蛋白形成病毒颗粒的相互作用力较弱,经高温或酸性缓冲液孵育后,无论是病毒滴度变化,还是RNA拷贝数的变化,均表现出热和酸不稳定趋势。因此,本研究结果表明SVA具有热与酸不稳定性,在特定条件下会影响病毒颗粒的稳定性。SVA感染引发的特发性水疱病在国内快速流行,研究SVA的热和酸稳定性,不仅有助于了解病毒的流行潜力,还有助于新型高效疫苗和热稳定保护剂的研发。

4 结论

本研究使用多个生物信息学软件对SVA衣壳蛋白的理化性质和热点残基进行了分析,发现衣壳蛋白并不稳定,热点残基较少,蛋白质间仅通过弱相互作用力结合而形成病毒颗粒。SVA病毒液在不同温度和不同pH缓冲液中孵育后,病毒滴度和RNA拷贝数均有所下降,证实SVA具有热和酸不稳定性。