土壤增氮对棉花当日花Bt杀虫蛋白含量影响及相关生理机制

刘雨婷, 李 远, 刘震宇, 何 润, 陈 晨, 戴雨阳, 陈 媛, 张 祥, 陈 源, 陈德华

(扬州大学农学院/ 江苏省作物遗传生理重点实验室/ 江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心, 江苏扬州 225009)

转Bt基因抗虫棉作为具有一定抗虫性的棉花品种类型,是全球乃至我国种植面积最大的转基因作物[1-4]。Bt棉在生产上的应用有效控制了棉铃虫及相关虫害的发生,减轻环境污染,降低棉田用工和植棉成本,取得显著的生态效益和经济效益[5-6]。因此, Bt棉抗虫性稳定、高效表达对棉花抗虫性的应用具有重要意义。但现有研究[7-8]表明, Bt棉仍存在抗虫性表达不稳定等问题,其主要原因是Bt杀虫蛋白的表达呈时空分布特征,即Bt杀虫蛋白的表达量随棉花生育期和器官的变化而变化。具体表现为时间上,杀虫蛋白含量随生育进程呈动态下降趋势且花铃期最低; 空间上,生殖器官中表达量低于营养器官[9-10]。陈媛等[11]研究发现缺氮条件下施用氮素能增加棉铃Bt杀虫蛋白含量,提高抗虫性。周明园等[12]报道根外喷施尿素能增加铃壳中Bt杀虫蛋白含量。但以往研究均是在土壤缺氮基础上探讨增加氮素或常规施氮水平上根外追氮对棉花叶片及蕾铃Bt抗虫性表达的影响,对当日花的抗虫性表达及其调节则鲜见报道。当日花作为棉铃虫危害的重要目标之一,其Bt杀虫蛋白的低表达量会引起更大危害,影响授粉受精和棉铃的形成,导致大量棉铃脱落,降低产量[13]。鉴此,本研究通过在常规施氮水平上,土壤增施25%～100%的氮素探讨土壤增氮对棉花当日花Bt杀虫蛋白表达的影响及相关生理机制,以期为增强Bt棉花的抗虫性提供理论与实践基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验于2017-2018年在扬州大学实验农牧场及遗传生理重点实验室进行。供试材料为Bt棉常规品种泗抗1号(SK-1)和杂交品种泗抗3号(SK-3)。2年均采用基质育苗移栽方式种植, 2017年于4月13日播种, 5月15日移栽至大田; 2018年于4月15日播种, 5月17日移栽至大田。土壤基础养分含量如下: 有机质含量18.8 g·kg-1, 水解氮130.5 mg·kg-1, 速效磷22.3 mg·kg-1, 速效钾83.3 mg·kg-1。

2017及2018年均设计5个施氮量水平,即300 (CK)、375 (N1)、450 (N2)、525 (N3)、600 (N4) kg·hm-2, 其中300 kg·hm-2(CK)为常规施氮量, N1—N4分别为在常规施氮量基础上增氮25%、50%、75%和100%。氮肥为尿素,于移栽、初花、盛花时分别施用20%、20%、60%。试验按裂区设计,每处理重复3次, 每小区种植6行, 小区面积为3.8 m2。SK-1种植密度为37 500株·hm-2, SK-3为27 000株·hm-2。磷钾肥用量相同,分别为过磷酸钙600 kg·hm-2、氯化钾375 kg·hm-2, 分别于移栽、初花时各施用50%。取样时选取长势一致的棉花植株,取第10果枝第1果节当日花,液氮冷冻后于-72 ℃超低温冰箱中保存待测。

1.2 测定项目与方法

Bt杀虫蛋白含量采用酶联免疫法(ELISA)[14]测定,试剂盒由中国农业大学提供; 可溶性蛋白质含量采用G-250考马斯亮蓝比色法[15]测定; 游离氨基酸含量采用抗坏血酸茚三酮染色法[16]测定; 谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)活性和谷氨酸合成酶(glutamate synthase, GOGAT)活性参照文献[17]方法测定; 按文献[18]方法计算蛋白酶和肽酶活性。

1.3 数据处理及统计分析

用Microsoft Excel 2016记录数据并制作图表,并运用IBM SPSS Statistics 22.0进行数据分析,采用最小显著差异法(LSD)进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 土壤增氮对当日花Bt杀虫蛋白含量的影响

由图1可知,两类型品种当日花Bt杀虫蛋白含量变化趋势一致, 2年均随施氮量的增加呈先升高后降低的趋势,最大值出现在N3处理,且显著高于CK。2017年,品种SK-1在N3处理下当日花Bt杀虫蛋白含量较CK增加85.1%; SK-3在N3处理下较CK增加60.6%。两类型品种间Bt杀虫蛋白含量无显著差异。这表明增施氮肥有利于提高当日花Bt杀虫蛋白含量,且土壤施氮量增加75%时,当日花中Bt杀虫蛋白增幅最大。

图1 土壤增氮对棉花当日花Bt杀虫蛋白含量的影响*Fig.1 Effects of increased nitrogen application on flower Bt protein concentration in Btcotton* 同一年份不同小写字母处理间差异显著(P<0.05)。* Different lowercase letters in the same year represent significant difference at 0.05 level among different treatments.

2.2 土壤增氮对当日花蛋白质代谢的影响

2.2.1 可溶性蛋白质和游离氨基酸含量

由表1可知,两类型品种当日花可溶性蛋白质含量变化趋势一致,均随施氮量增加呈先增加后降低的趋势,最大值基本出现在N3处理且显著高于CK。游离氨基酸含量变化呈相似的趋势,品种SK-1和SK-3基本在N3处理下增幅最大。品种间可溶性蛋白质和游离氨基酸含量无显著差异。这表明,土壤增氮有利于提高当日花可溶性蛋白质和游离氨基酸含量,且土壤施氮量增幅为75%时,增加效应最大。

表1 土壤增氮对棉花当日花可溶性蛋白和游离氨基酸含量的影响*Tab.1 Effects of increased nitrogen application on flower soluble protein concentration and free amino acid in Bt cotton

2.2.2 GS和GOGAT活性

由表2可知,两类型品种棉花当日花GS活性变化趋势一致, 2年GS活性均随施氮量增加呈先升高后下降趋势, N3处理达最大值,且与CK间差异显著。GOGAT活性表现类似变化趋势,品种SK-1和SK-3均在N3处理下达最大值, 2018年与CK相比分别显著增加59.7%和101.5%。两类型品种间GS和GOGAT活性无显著差异。这表明土壤增氮有利于当日花GS和GOGAT活性的提高,且施氮量增加75%时, GS活性增幅最大。

表2 土壤增氮对Bt棉当日花GS和GOGAT活性的影响*Tab.2 Effects of increased nitrogen application on flower GS and GOGAT activities in Bt cotton

2.2.3 蛋白酶和肽酶活性

由表3可知,两类型品种棉花当日花蛋白酶活性变化趋势相似, 2年均随施氮量增加呈逐渐下降趋势,最小值均出现在N4处理。2018年,品种SK-1在N4处理下当日花蛋白酶活性较CK降低31.7%; SK-3在N4处理下较CK降低41.2%。当日花肽酶活性呈类似变化趋势,品种SK-1和SK-3最小值均出现在N4处理下, 2018年分别比CK降低43.0%和43.1%。品种间蛋白酶和肽酶活性无显著差异。这表明土壤增氮有利于降低当日花蛋白酶和肽酶活性,且增施氮肥比例越大,降幅越大。

表3 土壤增氮对Bt棉当日花蛋白酶和肽酶活性的影响Tab.3 Effects of increased nitrogen application on flower protease and peptidase activities in Bt cotton

2.3 当日花氮代谢主要化合物及关键酶活性与Bt杀虫蛋白含量的关系

由图2、3可知,当日花中可溶性

图2 当日花可溶性蛋白质和游离氨基酸含量与Bt杀虫蛋白含量关系Fig.2 Relationship between soluble protein and free amino acid concentration and Bt insecticidal protein concentration in flowers* P<0.05, * * P<0.01。

图3 当日花GS和GOGAT活性与Bt杀虫蛋白含量关系Fig.3 Relationship between GS and GOGAT activities and Bt insecticidal protein concentration in flowers* P<0.05, * * P<0.01。

蛋白质含量、游离氨基酸含量及GS、GOGAT活性与Bt杀虫蛋白含量呈显著线性正相关(2017年相关系数分别为0.818*、0.970**、0.850**、0.930**, 2018年相关系数分别为0.907**、0.659*、0.960**、0.744*)。这进一步表明土壤增氮显著提高当日花中蛋白质合成相关酶的活性,进而促使氨基酸和可溶性蛋白含量显著提高,最终提高Bt杀虫蛋白含量。

3 小结与讨论

3.1 土壤适量增施氮肥有利于Bt棉当日花Bt杀虫蛋白含量增加

施用氮肥对Bt棉Bt杀虫蛋白含量有明显的影响,张祥等[19]研究发现叶面喷施尿素能促进Bt杀虫蛋白表达,显著提高Bt棉棉籽中Bt杀虫蛋白含量。衡丽[20]研究发现,在缺氮条件下棉蕾Bt杀虫蛋白表达量随施氮量增加而逐渐增加,并明确Bt杀虫蛋白表达量与氮代谢过程密切相关。但这些主要基于对常规施氮条件下根外追肥和缺氮条件下的研究结果。本研究在此基础上进一步研究在常规施氮水平上增氮对Bt棉当日花Bt杀虫蛋白含量的影响,结果发现,在常规施氮水平上增氮能增加当日花中Bt杀虫蛋白含量,且其含量增幅通常在常规施氮量的1.75倍时最大(525·kg·hm-2), 表明在土壤常规施氮基础上适量增氮有利于当日花Bt杀虫蛋白含量显著提高,有利于提高当日花抗虫性。但土壤增氮过多会引起棉花旺长[21], 蕾铃脱落显著增加,产量下降。本研究发现,土壤增氮50%时,蕾铃脱落增加14.7%, 产量下降11.3%; 土壤增氮75%时,蕾铃脱落增加27.87%, 产量下降29.6%。因此,虽然土壤增氮75%时当日花中Bt杀虫蛋白含量最高,但其产量损失严重,在实际生产中选择较低的増氮水平更有利于保持产量,因此如何通过增氮促进当日花Bt抗虫性和产量协同表达有待于进一步研究。

3.2 蛋白质合成代谢的显著增强是当日花Bt杀虫蛋白含量提高的主要原因

对于Bt棉抗虫性表达不稳定的机制,有报道[22-23]认为棉株体内丹宁等物质与Bt杀虫蛋白的结合、Bt基因的甲基化启动子失活、组织老化等均会影响Bt杀虫蛋白的表达。李远等[24]、Dong等[25]研究发现, Bt棉Bt杀虫蛋白的表达量与氮代谢过程关系密切。本研究结果表明,在常规施氮量基础上增氮,当日花中可溶性蛋白质和游离氨基酸含量变化趋势与Bt杀虫蛋白含量一致,均呈先增加后下降的趋势,最大值基本出现在常规施氮量的1.75倍(525·kg·hm-2)。而蛋白质合成关键酶GS、GOGAT活性也表现出相似趋势,蛋白质分解关键酶蛋白酶和肽酶活性则随施氮量增加呈逐渐下降的趋势。因此,蛋白质合成代谢增强是土壤增氮条件下Bt杀虫蛋白含量增加的主要原因。这由当日花氮代谢主要化合物可溶性蛋白质含量、游离氨基酸含量、蛋白质合成关键酶GS、GOGAT活性与Bt杀虫蛋白含量呈显著线形正相关得到进一步证明,因此促进花中蛋白质合成能力的增强有利于提高Bt棉的抗虫性。